class=\"container-fluid\">Supporting DataRelated ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsOn Page MenuProductsPrimary AntibodiesPhospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAbRecombinant：卓越的批次间一致性、持续供应和无动物制造。\">RRecombinant×什么是重组抗体及其重要性？

与传统抗体相比，重组抗体具有几个关键优势。这些优势包括批次间一致性、连续供应和无动物生产。因此，重组抗体是看到越来越多地用于科学研究，特别是作为解决持续的可重复性危机的一种手段。

什么是重组抗体？

传统的多克隆抗体和单克隆抗体是正常B细胞​​发育和基因重组的产物化。它们是通过用抗原对动物进行免疫以引发免疫反应而产生的。多克隆抗体由许多不同的 B 细胞克隆分泌并识别多个抗原表位，而单克隆抗体源自单个 B 细胞克隆并且仅针对一个表位。

重组抗体是单克隆抗体，但它们的产生涉及体外遗传操作。将抗体基因克隆到表达载体中后，将其转染到合适的宿主细胞系中进行抗体表达。哺乳动物细胞系最常用于重组抗体生产，尽管细菌、酵母或昆虫来源的细胞系也适用。

出色的批次间一致性

因为重组抗体生产涉及对抗体光进行测序和重型链条，这是一个高度可控且可靠的过程。相比之下，用于生产单克隆抗体的基于杂交瘤的系统容易发生遗传漂移和安装能力，增加批次间差异或抗体表达损失的可能性。重组抗体在批次之间高度一致，从而确保可重复的实验结果。

可扩展性

用于生产抗体的体外方法适合大规模生产，这意味着抗体可用性不太可能成为限制因素。此外，由于重组抗体序列已知，供应的连续性得到保证；在抗体将用于支持大型、长期研究的情况下，这可能是一个特别关键的因素。

无动物制造

与抗体生产的传统方法不同，重组方法无需使用动物。当多克隆抗体直接从免疫宿主的血清中纯化，单克隆抗体从杂交瘤来源的组织培养上清液或腹水中纯化时，重组抗体则从组织培养上清液中纯化 of 转染的宿主细胞系。无论抗体是多克隆抗体、单克隆抗体还是重组抗体，在实验使用之前，都必须始终在预期应用中对其进行适当验证。在 CST，我们遵守 Hallmarks of Antibody Validation™，这是确定抗体在任何给定测定中的特异性、灵敏度和功能的六种互补策略。通过针对每种抗体产品仔细定制这些策略，我们保证 CST 抗体将按预期发挥作用，帮助您获得值得信赖的结果。

Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb#13499Reviews ()Citations (71)过滤器：WBIPChIPC&R使用 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb 对 C2C12、H-4-II-E 和 COS-7 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。显示更少显示更多 使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（泳道 2）或 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb（泳道 3）对 HeLa 细胞提取物中的 Rpb1 进行免疫沉淀。泳道 1 是 10% 的输入。使用 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb 进行蛋白质印迹分析。 /product/image/13499_fig01_ChIP_82_20210423082552.jpg\" alt=\"Chromatin Immunoprecipitation Image 1: Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb\">使用来自 Hela 细胞的交联染色质和 Phospho-Rpb1 CTD ( Ser2) (E1Z3G) 兔单克隆抗体或 Rpb1 NTD (D8L4Y) 兔单克隆抗体 314958，使用 SimpleChIP® 酶促染色质 IP 试剂盒（磁珠）#9003。使用 DNA Library P 制备 DNA 文库Illumina® 的 rep 试剂盒（ChIP-seq，CUT&RUN）#56795。该图显示 12 号染色体上 ZNF740 基因的结合。显示更少显示更多 使用来自 Hela 细胞的交联染色质和 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb 进行染色质免疫沉淀或 Rpb1 NTD (D8L4Y) Rabbit mAb 314958，使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了跨 7 号染色体（上图）的结合，包括 ACTB（中图）、Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) 的已知靶基因（参见包含 ChIP-qPCR 数据的其他图）和 12 号染色体上的 ZNF740 基因（下图）。显示更少显示更多 使用来自 HeLa 细胞的交联染色质和 Phospho- Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb or Normal Rabbit IgG #2729 using SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003。使用 SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers 通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量 #2729 13653、人 β-肌动蛋白内含子 1 引物、SimpleChIP® Human β-Actin 3\' UTR Primers #13669 和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486。每个样本中免疫沉淀的 DNA 量表示为相对于总量的信号输入染色质的量，相当于一个。显示更少显示更多\" alt=\"剪切并运行图像 1：Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) 兔mAb\">CUT&RUN 使用 HCT 116 细胞和 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb，使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 进行。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) 制备 DNA 文库#56795. 该图显示了跨 ACTB 的结合，ACTB 是 Rpb1 的已知靶基因（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的附加图）。显示更少显示更多 CUT&RUN 使用 HCT 116 细胞和 Phospho- Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb，使用 CUT&RUN Assay Kit #86652。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。图中显示了跨 7 号染色体的结合（上图） ，包括 ACTB（下部），Rpb1 的已知靶基因（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的附加图）。显示更少显示更多 CUT&RUN 用 HeLa 细胞进行和 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb 或 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362，使用 CUT&RUN Assay Kit #86652。使用人 β-肌动蛋白内含子 1 引物和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486 通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量。每个样本中免疫沉淀的 DNA 量表示为相对于输入染色质总量的信号，相当于一个。显示更少显示更多 肽斑点印迹分析证明 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb 抗体特异性。使用 Phospho-Rpb1 CTD 显示抗体与预包被的 Rpb1 CTD 肽的结合（Ser2) (E1Z3G) 兔单克隆抗体、磷酸-Rpb1 CTD (Ser5) (D9N5I) 兔单克隆抗体 #13523、磷酸-Rpb1 CTD (Ser7) 抗体和磷酸-Rpb1 CTD (Ser2/Ser5) (D1G3K) 兔单克隆抗体 #13546 .正如预期的那样，Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb 仅在 Ser2 磷酸化时与磷酸化 Rpb1 CTD 肽结合。显示更少显示更多图片库详细了解我们如何获取图像 × Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G ) Rabbit mAb 13499 Toggle Between Dark and Light ModesFilter:WBIPChIPC&R 使用 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb 对 C2C12、H-4-II-E 和 COS-7 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析. 使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（泳道 2）或 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb（泳道 3）对 HeLa 细胞提取物中的 Rpb1 进行免疫沉淀。泳道 1 为 10 % 输入。使用 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb 进行蛋白质印迹分析。使用来自 Hela 细胞的交联染色质和 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) 进行染色质免疫沉淀) 兔单克隆抗体或 Rpb1 NTD (D8L4Y) 兔单克隆抗体 314958，使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了 12 号染色体上 ZNF740 基因的结合。使用来自 Hela 细胞的交联染色质和 Phospho-Rpb1 CTD ( Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb or Rpb1 NTD (D8L4Y) Rabbit mAb 314958，使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) 制备 DNA 文库#56795. 该图显示了跨 7 号染色体（上）的结合，包括 ACTB（中）、Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) 的已知靶基因（参见包含 ChIP-qPCR 数据的附加图）和 12 号染色体上的 ZNF740 基因（ 使用来自 HeLa 细胞的交联染色质进行染色质免疫沉淀和 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb 或 Normal Rabbit IgG #2729 使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003。使用 SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653、人 β-Actin 内含子 1 引物、SimpleChIP® Human β-Actin 3\' UTR Primers #13669 和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat 通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量引物#4486。每个样本中免疫沉淀的 DNA 量表示为相对于输入染色质总量的信号，相当于一个。 CUT&RUN 使用 HCT 116 细胞和 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb，使用 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。该图显示了跨 ACTB 的绑定，aRpb1 的已知目标基因（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的附加图）。 CUT&RUN 使用 HCT 116 细胞和 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb，使用 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。这些图显示了跨 7 号染色体（上图）的结合，包括 ACTB（下图），Rpb1 的一个已知靶基因（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的附加图）。 CUT&RUN 使用 HeLa 细胞和 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb 或 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362，使用 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652。使用人 β-肌动蛋白内含子 1 引物和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486 通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量。每个样本中免疫沉淀的 DNA 量表示为相对于输入染色质总量的信号，相当于一个。 肽斑点印迹分析证明了 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) 兔单克隆抗体的特异性。使用 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb，Phospho-Rpb1 CTD (Ser5) (D9N5I) Rabbit mAb #13523，磷酸 Rpb1 CTD (Ser7) 抗体，显示抗体与预包被的 Rpb1 CTD 肽的结合，和 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/Ser5) (D1G3K) 兔单克隆抗体 #13546。正如预期的那样，Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb 仅在 Ser2 磷酸化时与磷酸化 Rpb1 CTD 肽结合。购买 #13499Cat。 #SizeQty.Price13499S100µl$367

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探索我们用于 ChIPCompare DataAntibody Guarantee 的 Rpb1 产品组合FAQTech Support-- Datasheet --Without ImagesWith ImagesSDS: Choose Your RegionAmerica - EnglishEurope - ChineseEurope - DutchEurope - EnglishEurope - FrenchEurope - GermanEurope - ItalianEurope - KoreanEurope - PortugueseEurope - SpanishEurope - SwedishCertificate of AnalysisRelated ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsSupporting DataREACTIVITYH M R MkSENSITIVITYEndogenousMW (kDa)250Source/IsotypeRabbitIgGApplication Key:WB-Western BlotIP-免疫沉淀I HC-免疫组化ChIP-染色质免疫沉淀C&R-CUT&RUNC&T- CUT&TagDB-Dot BloteCLIP-eCLIPIF-免疫荧光F-流式细胞术物种交叉反应键：H-HumanM-MouseR-RatHm-HamsterMk-MonkeyVir-VirusMi-MinkC-ChickenDm-D。 melanogasterX-XenopusZ-ZebrafishB-BovineDg-DogPg-PigSc-S。酿酒酵母 Ce-C. elegansHr-HorseGP-Guinea PigRab-RabbitAll-All Species ExpectedRelated ProductsConjugates

产品信息

产品使用信息为了获得最佳的 ChIP 和 ChIP-seq 结果，使用 10 μl 抗体和 10 μg 染色质（约4 x 106 个单元）每个 IP。该抗体已使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kits 进行了验证。使用 CUT&RUN 检测试剂盒 #86652 确定 CUT&RUN 稀释。ApplicationDilutionWestern Blotting1:1000Immunoprecipitation1:50Chromatin IP1:50Chromatin IP-seq1:50CUT&RUN1:50StorageSupplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50%甘油和少于 0.02% 的叠氮化钠。储存于 –20°C。不要等分抗体。方案选择您的方案Western BlottingImmunoprecipitationChromatin IPChromatinIP-seqCUT&RUNPRINT

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Western Blotting Protocol

对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中孵育4°C 轻轻摇动过夜。

注意：推荐的抗体稀释度请参考一抗产品网页。

A.溶液和试剂

从样品制备到检测，Western Blot 所需的试剂现在都在一个方便的试剂盒中：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：用反渗透去离子（ ... (#12498) 要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH2O，混合。1X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包 (#7722) 或红色上样包 (#7723) 通过添加准备新鲜的 3X 还原上样缓冲液1/10 体积的 30X DTT 到 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液。地卢使用 dH2O.10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液转为 1X：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH2O 中，混合。10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：(#12539)要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，混合。10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST：添加 100 ml 10X TBST 至 900 ml dH2O，混合。脱脂奶粉：(#9999)。封闭缓冲液：1X TBST 含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加到 150 ml 1X TBST 中并充分混合。洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。一抗稀释缓冲液：1X TBST 与 5 ％牛血清白蛋白；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。生物素化蛋白 Ladder 检测包：(#7727)。蓝色预染蛋白标记物，宽范围 (11-250 kDa)：(#59329)。印迹膜和纸：(#12369) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。一般推荐孔径 0​​.2 µm. 与 HRP 偶联的二抗：抗兔 IgG，HRP 连接抗体 (#7074)。检测试剂：SignalFire™ ECL 试剂 (#6883).B. Protein BlottingA general protocol for sample preparation. 通过在所需时间内添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞。用 1X PBS 清洗细胞；吸出。通过添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径板每孔 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移到微量离心管中。保持在冰上。超声处理 10-15 秒以完成细胞裂解和剪切 DNA（以降低样品粘度）。将 20 µl 样品加热至 95-100°C 5 分钟；在冰上冷却。微量离心 5 分钟。

将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶（10 厘米 x 10 厘米）上。

注意：上样预染分子量标记（#59329，10 µl/推荐使用 lane) 验证电转移和生物素化蛋白质 ladder（#7727，10 µl/lane）以确定分子量。

Electrot转移到硝酸纤维素膜 (#12369).C.膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，相应地调整体积。

I.膜封闭（可选） 转移后，在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。将膜在 25 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。二。一抗孵育将膜和一抗（按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂）在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育，在 4°C 下轻轻搅拌过夜。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。将膜与 Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody（#7074，1:2000）和抗生物素、HRP-linked Antibody（#7075，1:1000–1:3000）一起孵育，以检测 10 ml 中的生物素化蛋白质标记物封闭缓冲液在室温下轻轻搅拌 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。继续检测（D 部分）。蛋白质检测使用说明：在 TBST 中将膜结合的 HRP（抗体偶联物）洗涤 3 次，每次 5 分钟。通过稀释一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B（例如，用于 10毫升，加入 5 毫升试剂 A 和 5 毫升试剂 B）。充分混合。将底物与膜一起孵育 1 分钟，去除多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露在 X 射线胶片上。

* 避免反复接触皮肤。

2005 年 6 月发布

2020 年 6 月修订

方案 ID：10

天然蛋白质的免疫沉淀

本方案是旨在利用蛋白 A 琼脂糖珠对天然蛋白进行免疫沉淀，以通过蛋白质免疫印迹或激酶活性进行分析。

A.溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

20X 磷酸盐缓冲液红盐水 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 的 1X PBS，将 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH2O 中，混匀。

10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 制备 10 ml 的 1X 细胞裂解液缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加到 9 ml dH2O 中，混合。

注意：在使用前立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

3X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包（ #7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液中来制备新鲜的 3X 还原加载缓冲液。蛋白 A 琼脂糖珠：(#9863).10X 激酶缓冲液（用于激酶测定）：（#9802）要制备 1 ml 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加到 900 μl dH2O 中，混合 ATP (10 mM)（用于激酶测定）：(#9804) 制备 0.5 ml ATP (200 µM)，将 10 µl ATP (10 mM) 添加到 490 µl 1X 激酶缓冲液中。B.准备细胞裂解物吸出培养基。通过添加含有调节剂的新鲜培养基达到所需时间来处理细胞。要在非变性条件下收获细胞，去除培养基并用冰冷的 1X PBS 冲洗细胞一次。去除 PBS 并加入 0.5 ml 冰冷的将 1X 细胞裂解缓冲液加入每个板（10 厘米）并在冰上孵育 5 分钟。从板上刮下细胞并转移到微量离心管中。保持在冰上。在冰上超声处理 3 次，每次 5 秒。在 4°C 下以 14,000 x g 微量离心 10 分钟，并将上清液转移到新管中。上清液是细胞裂解物。如有必要，可将裂解物储存在 -80°C.C 下。免疫沉淀细胞裂解物预清除（可选）涡旋混合珠子。将 10–30 µl 50% 蛋白 A 琼脂糖珠浆添加到 200 µl 细胞裂解物中，浓度为 1 mg/ml。在 4°C 下旋转孵育 30–60 分钟。 4°C 微量离心 10 分钟。将上清液转移到新试管中。继续进行下面的免疫沉淀。免疫沉淀

重要提示：强烈建议使用适当的同种型对照，以显示一抗免疫沉淀中的特异性结合。对兔多克隆一抗使用 Normal Rabbit IgG #2729，对兔单克隆一抗使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900抗体，Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠单克隆 IgG1 一抗，Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠单克隆 IgG2a 一抗，Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠单克隆 IgG2b一抗和 Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠单克隆 IgG3 一抗。同种型对照应浓度匹配并与一抗样品一起运行。

将一抗（按照产品数据表中推荐的适当稀释度）以 1 mg/ml 的浓度添加到 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜。添加蛋白 A 琼脂糖（10–30 µl 50% 珠浆）。在 4°C 下旋转孵育 1-3 小时。在 4°C 下微量离心 30 秒。用 500 µl 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物五次。在两次清洗之间保持在冰上。通过蛋白质免疫印迹或激酶活性（D 部分）进行样品分析。样品分析

进行以下操作之一ng 特定的一组步骤。

通过蛋白质免疫印迹分析用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀。涡旋，然后以 14,000 x g 微量离心 30 秒。将样品加热至 95-100°C 2-5 分钟，然后以 14,000 x g 微量离心 1 分钟。将样品 (15-30 µl) 装入 4-20 % 用于 SDS-PAGE 的凝胶。通过蛋白质印迹分析样品（参见蛋白质免疫印迹实验方案）。

注意：当使用兔中产生的一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Mouse Anti -兔 IgG（轻链特异性）(D4W3E) mAb (#45262)​​ 或小鼠抗兔 IgG（构象特异性）(L27A9) mAb (#3678)（或 HRP 偶联物 #5127）作为二抗，以尽量减少产生的干扰由变性兔重链。对于分子量在 25 kDa 范围内的蛋白质，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）以尽量减少变性小鼠 li 产生的干扰

当使用小鼠产生的一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP结合）（#58802）作为二抗，以最大限度地减少变性小鼠重链产生的干扰。

通过激酶分析进行分析用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。保持在冰上。将沉淀悬浮在 40 µl 1X 激酶缓冲液中，辅以 200 µM ATP 和适当的底物。在 30°C 下孵育 30 分钟。用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋，然后微量离心 30 秒。将含有磷酸化底物的上清液转移到另一个管中。将样品加热至 95-100°C 2-5 分钟，然后以 14,000 x g 微量离心 1 分钟。加载样品 (15-30 µl) SDS-PAGE (4–20%)。

2008 年 12 月发布

2021 年 10 月修订

方案 ID：409

IP

特定于产品：SimpleChIP® Plus Enzymatic染色质 IP 试剂盒（磁珠）#9005。

所需试剂

包括的试剂：

甘氨酸溶液 (10X) #7005Buffer A (4X) #7006Buffer B (4X) #7007ChIP Buffer (10X) # 7008ChIP 洗脱缓冲液 (2X) #70095 M NaCl #70100.5 M EDTA #7011ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006DNA Binding Buffer #10007DNA Wash Buffer（使用前加入 4 倍体积的乙醇）#10008DNA Elution Buffer #10009DNA 纯化柱和收集管 # 10010蛋白酶抑制剂混合物 (200X) #7012RNAse A (10 mg/ml) #7013Micrococcal Nuclease #10011Proteinase K (20 mg/ml) #10012SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015Histone H3 (D2B12 ) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620Normal Rabbit IgG #2729DTT (Dithiothreitol) #7016

不包括试剂

Magnetic Separation Rack #7017 / 14654Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2（无菌) #9872Nuclease-free Water #12931Ethanol (96-100%)Formaldehyde (37% Stock)SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix#88989！这个！表示协议中关于基于免疫沉淀准备 (IP 准备) 数量的体积变化的重要步骤。一份 IP 制备定义为 4 x 106 个组织培养细胞或 25 mg 或分解组织。！！这 !!表示在继续之前稀释缓冲区的重要步骤。安全停止如果需要停止，这是协议中的安全停止点。组织交联和样品制备

采集组织时，从样品中去除不需要的物质，例如脂肪和坏死物质。然后可以立即对组织进行处理和交联，或在干冰上冷冻并储存在 -80°C 下供以后处理。为获得最佳染色质产量和 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用 25 mg 组织。染色质产量确实因组织类型而异，有些组织每次免疫沉淀可能需要超过 25 mg。有关预期染色质的更多信息，请参阅附录 A不同类型组织的产量。应处理一份额外的染色质样品以进行染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。如果需要，应处理另外五个染色质样品以优化染色质消化（附录 B）。

开始前：

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中 IP 制备的数量按比例增加.

取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) 和 10X 甘氨酸溶液。确保 PIC 完全解冻。每 25 mg 待处理组织准备 3 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 15 µl 200X PIC 并置于冰上。每 25 mg 待处理组织准备 45 µl 37% 甲醛并保持在室温下。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。交联称重新鲜或冷冻的组织样本。对每个要执行的 IP 使用 25 mg 的组织（在或中的一项实验至少需要 75 mg 的组织）der 以包括阳性和阴性对照）。将组织样本放入 60 毫米或 100 毫米的培养皿中，并使用干净的手术刀或刀片切碎。把菜放在冰上。保持组织低温以避免蛋白质降解很重要。将切碎的组织转移到 15 ml 锥形管中。向锥形管中每 25 mg 组织添加 1 ml PBS + PIC。要将蛋白质交联到 DNA，添加 45 µl 37每 1 ml PBS + PIC 的甲醛百分比，并在室温下摇晃 20 分钟。最终甲醛浓度为 1.5%。通过每 1 ml PBS + PIC 添加 100 µl 10X 甘氨酸来停止交联，并在室温下混合 5 分钟。在台式离心机中以 500 x g 在 4°C 下将组织离心 5 分钟.去除上清液，每 25 mg 组织用 1 ml PBS + PIC 洗涤一次。在台式离心机中在 4°C 下以 500 x g 重复离心 5 分钟。去除上清液，每 25 mg 组织用 1 ml PBS + PIC 重悬组织并储存在冰上。使用 Me 将组织分解成单细胞悬液dimachine（B 部分）或 Dounce 均质器（C 部分）。 （安全停止）或者，样品可以在分解前在 -80°C 下储存长达 3 个月。B.使用 BD Biosciences 的 Medimachine 进行组织分解（部件号 340587）切掉 1000 µL 移液器尖端的末端以扩大用于转移组织块的开口。将重悬于 PBS + PIC 中的 1 ml 组织转移到 50 mm 的顶部腔室中medicone（部件号 340592）。根据制造商的说明研磨组织 2 分钟。使用 1 ml 注射器和 18 号钝针从 medicone 的底部室收集细胞悬浮液。将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中并置于冰上。重复步骤 2 至 4，直到所有组织都处理成均质悬浮液。如果需要更多研磨，请向组织中添加更多 PBS + PIC。重复步骤 2 到 5，直到所有组织都被研磨成均匀的悬浮液。通过显微镜（可选）检查单细胞悬浮液。在工作台上以 2,000 x g 的速度离心细胞以p 在 4°C 下离心 5 分钟。从细胞中去除上清液并继续进行细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。C。使用 Dounce 匀浆器进行组织分解将重新悬浮在 PBS + PIC 中的组织转移到 Dounce 匀浆器中。用 20-25 次冲程分解组织块。通过显微镜检查单细胞悬浮液（可选）。将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中，并在台式离心机中 4°C 下以 2,000 x g 离心 5 分钟。从细胞中去除上清液并继续进行细胞核制备和染色质消化（第三部分）。细胞培养物交联和样品制备

为获得最佳 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 4 X 106 个细胞（至少需要 12 X 106 个细胞以包括阳性和阴性对照）。对于 HeLa 细胞，一个 IP 相当于 15 cm 培养皿的一半，其中含有在 20 ml 生长培养基中达到 90% 汇合度的细胞。一个额外的样品寿ld 被处理用于染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。由于每种细胞类型都不同，我们建议在实验中加入一皿额外的细胞，用于使用血细胞计数器或细胞计数器测定细胞数量。

开始之前

(!) 所有缓冲液体积都应增加根据使用的 15 cm 组织培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）的数量按比例分配。

取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 和 10X Glycine Solution #7005。确保 PIC 完全解冻。准备 2 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 10 µl 200X PIC 每 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）进行处理并置于冰上。每 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）准备 40 ml PBS待处理并置于冰上。每 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）准备 540 µl 37% 甲醛以进行处理并在室温下保存。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛离子日期。要将蛋白质与 DNA 交联，请将 540 µl 37% 甲醛添加到每个包含 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿中。对于悬浮细胞，向悬浮在 20 ml 培养基中的细胞中加入 540 µl 37% 甲醛（为实现悬浮细胞的最佳固定，固定时细胞密度应低于 0.5 x 106 个细胞/ml）。短暂旋转以混合并在室温下孵育 10 分钟。最终甲醛浓度为 1%。添加甲醛可能会导致培养基颜色发生变化。将 2 ml 10X 甘氨酸添加到每个含有 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿中，短暂旋转以混合，并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能会导致培养基颜色发生变化。对于悬浮细胞，将细胞转移到 50 ml 锥形管中，在台式离心机中 4°C 下以 500 x g 离心 5 分钟，然后用 20 ml 冰洗涤沉淀两次冷 PBS。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。对于贴壁细胞，rem转移培养基并用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞两次，每次完全去除培养皿中的洗涤液。向每个 15 cm 的培养皿中加入 2 ml 冰冷的 PBS + PIC。将细胞刮入冷缓冲液中。将所有培养皿中的细胞合并到一个 15 ml 锥形管中。在 4°C 的台式离心机中以 2,000 x g 离心细胞 5 分钟。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。 （安全停止）或者，样品可以在 -80°C 下储存长达 3 个月。III。细胞核制备和染色质消化开始之前

(!) 所有缓冲液体积都应根据实验中 IP 制备的数量按比例增加。

取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012。确保在使用前完全解冻。准备 1 M DTT（192.8 mg DTT #7016 + 1.12 ml dH2O）。确保 DTT 晶体完全溶解。

(!!)重要提示：溶解后，将 1M DTT 储存在 -20°C 下。

取出并加热 10XChIP 缓冲液 #7008 并确保 SDS 完全溶解。准备 1 ml 1X 缓冲液 A（250 µl 4X 缓冲液 A #7006 + 750 µl 水）+ 0.5 µl 1M DTT + 5 µl 200X PIC 每个 IP 准备并置于冰上。准备1.1 ml 1X 缓冲液 B（275 µl 4X 缓冲液 B #7007 + 825 µl 水）+ 0.55 µl 1M DTT 每次 IP 制备并置于冰上。制备 100 µl 1X ChIP 缓冲液（10 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 90 µl 水） + 0.5 µl 200X PIC 每次 IP 准备并置于冰上。在 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 A + DTT + PIC 每次 IP 准备中重悬细胞。在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟通过倒置管混合。在 4°C 的台式离心机中以 2,000 x g 离心 5 分钟沉淀细胞核。每次 IP 制备时，去除上清液并在 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。重复离心，去除上清液，并在每次 IP 制备时在 100 µl 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。将样品转移到 1.5 ml 微量离心管中，每管最多 1 ml。添加 0.5 µl Micrococcal Nuclease #10011 每次 IP 制备，通过倒置试管多次混合并在 37°C 下孵育 20 分钟并频繁混合以将 DNA 消化至大约 150-900 bp 的长度。每 3 至 5 分钟颠倒混合一次。将 DNA 消化至最佳长度所需的微球菌核酸酶的量可能需要根据个体组织和细胞系的经验确定（参见附录 B）。每 4 x 106 个细胞用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化的 HeLa 细胞核和每 25 mg 组织用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化的小鼠肝组织得到适当长度的 DNA 片段。通过每次免疫沉淀制备添加 10 µl 0.5 M EDTA #7011 来停止消化并将试管置于冰上 1-2 分钟。通过在 4°C 下以 16,000 x g 离心在微量离心机中离心 1 分钟并去除上清液来沉淀细胞核。在 100 µl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬核沉淀，并孵育冰 10 分钟。每 1.5 ml 微量离心机处理多达 500 µl 裂解物用几个脉冲打破核膜的管子。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可以通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定。使用 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/声波仪，在设置 6 和 1/8 英寸探头的 3 组 20 秒脉冲后，HeLa 细胞核被完全裂解。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不完全。通过在 4°C 下在微量离心机中以 9,400 x g 离心 10 分钟来澄清裂解物。将上清液转移到新管中。 （安全停止）这是交联染色质制剂，应在 -80°C 下储存直至进一步使用。取出 50 µl 染色质制备物用于染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。该 50 µl 样品可在 -20°C 下储存过夜。染色质消化分析浓度（推荐步骤）向 50 µl 染色质样品（来自第 III 部分中的步骤 9）添加 100 µl 无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl #7010 和 2 µl RNAse A #7013。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中添加 2 µl 蛋白酶 K。涡旋混合并在 65°C 下孵育样品 2 小时。使用 DNA 纯化离心纯化样品中的 DNA列如第 VII 节所述。 （安全停止）DNA 可在 -20°C 下保存长达 6 个月。纯化 DNA 后，取出 10 µl 样品，并在带有 100 bp DNA 标记的 1% 琼脂糖凝胶上通过电泳确定 DNA 片段大小。 DNA 应被消化至大约 150-900 bp 的长度（1 至 5 个核小体）。要确定 DNA 浓度，请将 2 µl 纯化的 DNA 转移到 98 µl 无核酸酶的水中进行 50 倍稀释并读取 OD260。以 µg/ml 为单位的 DNA 浓度为 OD260 x 2,500。 DNA浓度应该理想浓度介于 50 和 200 µg/ml 之间。

注意：要获得最佳的 ChIP 结果，染色质的大小和浓度是否合适非常关键。染色质的过度消化可能会减少 PCR 定量中的信号。染色质消化不足可能导致背景信号增加和分辨率降低。在 IP 中添加的染色质太少可能会导致 PCR 定量中的信号减弱。染色质消化优化方案见附录 B.

V。染色质免疫沉淀

为获得最佳 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 µg 消化的交联染色质（如第 IV 部分中所确定）。这应该大致相当于从 25 mg 分解组织或 4 x 106 个组织培养细胞中制备的 100 µl IP 制备物。通常，在添加抗体之前，将 100 µl 消化的染色质稀释到 400 µl 1X ChIP 缓冲液中。然而，如果超过 100 µl 的染色质被每个 IP 都需要，交联的染色质制剂不需要按如下所述进行稀释。抗体可直接添加到未稀释的染色质制剂中，用于染色质复合物的免疫沉淀。

开始之前

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中的免疫沉淀数量按比例增加。

去除和温暖的 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解。解冻消化的染色质制备物（来自第 III 部分的第 9 步）并置于冰上。准备低盐洗涤液：3 ml 1X ChIP Buffer （300 微升 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 2.7 毫升水）每次免疫沉淀。在室温下储存直至使用。准备高盐洗涤液：每次免疫沉淀 1 ml 1X ChIP 缓冲液（100 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 900 µl 水）+ 70 µl 5M NaCl #7010。在室温下储存直至使用。在一根试管中，准备足够的h 1X ChIP 缓冲液，用于将消化的染色质稀释成所需数量的免疫沉淀：每次免疫沉淀 400 µl 1X ChIP 缓冲液（40 µl 10X ChIP 缓冲液 + 360 µl 水）+ 2 µl 200X PIC。确定免疫沉淀次数时，请记住包括阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620 和阴性对照 Normal Rabbit IgG antibody #2729 样品。将混合物置于冰上。每次免疫沉淀时，向制备好的 1X ChIP 缓冲液中添加相当于 100 µl（5 至 10 µg 染色质）的消化交联染色质制剂（来自第 III 部分的第 9 步）。例如，对于 10 次免疫沉淀，准备一个含有 4 ml 1X ChIP 缓冲液（400 µl 10X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 µl 200X PIC + 1 ml 消化染色质制剂的试管。取出 10 µl 稀释染色质样品并转移到微量离心管。这是您的 2% 输入样本，可以存储在 -20&d例如；C 直到进一步使用（第 VI 部分中的步骤 1）。对于每次免疫沉淀，将 500 µl 稀释的染色质转移到 1.5 ml 微量离心管中并添加免疫沉淀抗体。每个 IP 所需的抗体量各不相同，应由用户确定。对于阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620，向 IP 样品中添加 10 µl。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729，将 1 µl（1 µg）到 2 µl（2 µg）添加到 IP 样品中。如果使用 Cell Signaling Technology 的抗体，请参阅数据表或产品网页上列出的推荐稀释度，并根据 Cell Signaling 抗体浓度计算阴性对照的 IgG 抗体量 (µg)，以进行公平比较。将 IP 样品在 4°C 下旋转孵育 4 小时至过夜。

注意：Cell Signaling Technology 的大多数抗体在每个 IP 样品 1 到 2 微克之间发挥最佳作用。在有多个样本的情况下不同浓度，最好将阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。

通过轻轻涡旋重悬 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006。立即向每个 IP 反应中添加 30 µl 蛋白 G 磁珠，并在 4°C 下旋转孵育 2 小时。通过将试管置于磁力分离架 #7017 中，在每次免疫沉淀中沉淀蛋白 G 磁珠。等待 1 至 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。通过向磁珠中加入 1 ml 低盐洗涤液来清洗 G 蛋白磁珠，并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。再重复步骤 6 和 7 两次，共进行 3 次低盐洗涤。将 1 ml 高盐洗涤液加入磁珠中，并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。通过将磁选架中的试管。等待 1 至 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。伊梅立即进入第 VI.VI 节。从抗体/蛋白 G 磁珠洗脱染色质和逆转交联开始之前

(!) 所有缓冲液体积应根据实验中的免疫沉淀数量按比例增加。

取出并加热 2X ChIP 洗脱在 37°C 水浴中缓冲 #7009，并确保 SDS 在溶液中。将水浴或热混合器设置为 65°C。准备 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液（75 µl 2X ChIP 洗脱缓冲液 #7009 + 75 µl 水）用于每次免疫沉淀和 2% 输入样品。将 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液添加到 2% 输入样品管中，并在室温下放置直至步骤 6。向每个 IP 样品添加 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液。从中洗脱染色质抗体/蛋白 G 磁珠在 65°C 下轻轻涡旋（1,200 rpm）30 分钟。恒温器最适合此步骤。或者，洗脱可以在室温下旋转进行，但可能不像 complete. 将管子放在磁力分离架上沉淀蛋白 G 磁珠，等待 1 到 2 分钟使溶液澄清。小心地将洗脱的染色质上清液转移到新管中。到所有管子，包括步骤 1 中的 2% 输入样品，通过添加 6 µl 5M NaCl 和 2 µl Proteinase K #10012 进行反向交联，并在 65°C 下孵育 2 小时。该孵育可以延长过夜。立即进行第七部分。 （安全停止）或者，样品可以在 -20°C 下储存最多 4 天。但是，为避免形成沉淀，请确保在添加 DNA Binding Buffer #10007 之前将样品加热至室温（第 VII 部分，步骤 1）。VII。使用离心柱纯化 DNA 开始前 (!!) 使用前将 24 ml 乙醇 (96-100%) 添加到 DNA Wash Buffer #10008 中。此步骤只需在第一组 DNA 纯化之前执行一次。从第 V 部分中取出每个 DNA 样本的 DNA 纯化收集管 #10010。添加 750 µl DNA Bind将缓冲液 #10007 添加到每个 DNA 样品中并短暂涡旋。每 1 体积样品应使用 5 倍体积的 DNA 结合缓冲液。将步骤 1 中的每个样品 450 µl 转移至收集管中的 DNA 离心柱。以 18,500 x g 离心在微量离心机中离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并弃去液体。更换收集管中的离心柱。将步骤 1 中每个样品剩余的 450 µl 转移到收集管中的离心柱中。重复步骤 3 和 4。将 750 µl DNA Wash Buffer #10008 添加到收集管中的离心柱。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并弃去液体。更换收集管中的离心柱。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。丢弃收集管和液体。保留离心柱。向每个离心柱中添加 50 µl DNA Elution Buffer #10009，然后放入干净的 1.5 ml 微量离心管中。Cen在微量离心机中以 18,000 x g 离心 30 秒以洗脱 DNA。移除并丢弃 DNA 离心柱。洗脱液现在是纯化的 DNA。 （安全停止）样品可以储存在 -20°C。VIII。通过 PCR 对 DNA 进行定量建议使用带过滤头的移液器吸头以最大限度地降低污染风险。试剂盒中包含的对照引物专用于人或小鼠 RPL30 基因 (#7014 + #7015)，可用于标准 PCR 或定量实时定量时间 PCR。如果用户对其他物种进行 ChIP，建议用户针对 DNA 设计合适的特异性引物并确定最佳 PCR 条件。建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度地降低非特异性 PCR 产物的风险。PCR 引物选择很关键。引物设计应严格遵守以下标准：引物长度：24 个核苷酸最佳 Tm：60°CO 最佳 GC：50% 扩增子大小：150 至 200 bp（用于标准 PCR）80 至 160 bp（用于实时定量 PCR）标准的d PCR 方法根据要分析的样本数量标记适当数量的 0.2 ml PCR 管。这些应包括 2% 输入样本、阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本，以及一个没有 DNA 的试管以控制 DNA 污染。向每个试管中加入 2 µl 适当的 DNA 样本。准备一个主反应混合物如下所述，确保为两个额外的管添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个反应管中加入 18 µl 预混液。1 个 PCR 反应的试剂体积 (18 µl) 无核酸酶 H2O 12.5 µl10X PCR 缓冲液 2.0 µl4 mM dNTP 混合物 1.0 µl5 µM RPL30 引物 2.0 µlTaq DNA 聚合酶 0.5 µl 开始以下 PCR 反应程序： A。初始变性 95°C 5 分钟。变性 95°C 30 秒。退火 62°C 30 秒。延伸 72°C 30 秒。重复步骤 b-d 总共 34 个周期。最终延伸 72°C 5 分钟去除每个 PCR p 的 10 µl用于通过 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳和 100 bp DNA 标记进行分析的产品。人 RPL30 #7014 的 PCR 产物的预期大小为 161 bp，小鼠 RPL30 #7015 的预期大小为 159 bp。实时定量 PCR 方法标记与要使用的 PCR 机器型号兼容的适当数量的 PCR 管或 PCR 板。 PCR 反应应包括阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本、不含用于控制污染的 DNA 的试管，以及连续稀释的 2% 输入染色质 DNA（未稀释、1:5、1:25 , 1:125) 以创建标准曲线并确定扩增效率。将 2 µl 适当的 DNA 样本添加到 PCR 板的每个试管或孔中。如下所述制备主反应混合物。为两个额外的反应添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个 PCR 反应管或孔中加入 18 µl 反应混合物。 （安全停止）必要时用铝箔盖板避光并在 4°C 下储存最多 4 小时或 -20°C 过夜，直到机器准备好使用。1 次 PCR 反应的试剂体积 (18 µl)无核酸酶 H2O 6 µl5 µM RPL30 引物 2 µlSimpleChIP® 通用 qPCR Master Mix #88989 10 µl 启动以下 PCR 反应程序：a.初始变性 95°C 3 分钟。变性 95°C 15 秒。退火和延伸：60°C 60 秒。重复步骤 b 和 c，共进行 40 个循环。

使用实时 PCR 仪提供的软件分析定量 PCR 结果。或者，可以使用百分比输入法和下面显示的等式手动计算 IP 效率。使用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表示为总输入染色质的百分比。

输入百分比 = 2% x 2(C[T] 2% 输入样本 - C[T] IP 样本)

C[T] = CT = PCR反应的阈值循环

IX. NG-Sequencing Library Construction

免疫富集的DNA样本使用此试剂盒制备的试剂盒与 ChIP-seq 直接兼容。对于下游 NG 测序 DNA 文库构建，请使用与您的下游测序平台兼容的 DNA 文库制备方案或试剂盒。对于 Illumina® 平台上的测序，我们推荐用于 Illumina® 的 DNA 文库制备试剂盒（ChIP-seq、CUT&RUN）#56795 和其相关的索引引物 Multiplex Oligos for Illumina®（单索引引物）（ChIP-seq，CUT&RUN）#29580 或 Multiplex Oligos for Illumina®（双索引引物）（ChIP-seq，CUT&RUN）#47538。

建议：

对于转录因子或辅因子 ChIP-seq，使用至少 5 ng ChIP 富集的 DNA 并使用 10 个 PCR 循环扩增接头连接的 DNA。对于总组蛋白和组蛋白修饰，或输入样本，从 50 ng 的 ChIP 富集 DNA 开始，并使用 6 个 PCR 循环扩增接头连接的 DNA。对于所有目标类型的 ChIP 富集 DNA 的文库构建，执行接头连接的 DNA 的清理DNA 文库构建后，使用安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒（安捷伦科技，目录号 G2938-90322）或通过琼脂糖凝胶电泳使用 50-100 ng DNA 在 2% 琼脂糖 TAE 凝胶上。如果 DNA 文库中存在接头二聚体，则重复 PCR 扩增材料的清理。文库的质量也可以使用 qPCR 和针对已知阳性和阴性目标位点的引物组来确认。阳性引物对仍应提供与比较相同的高信号如在对 ChIP 富集的 DNA 的原始 qPCR 分析中所见，为阴性引物。在最终清理和质量检查后，准备 2-10 nM 的最终纯化文库样本以进行高通量测序。附录 A：预期染色质产量

收获杂交时来自组织样本的连锁染色质，染色质的产量在不同组织类型之间可能存在显着差异。右表提供了染色质 f 的预期产量范围rom 25 mg 组织与 4 x 106 HeLa 细胞相比，以及预期的 DNA 浓度，如协议第 IV 节中所确定。对于每种组织类型，使用 Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 均质器进行分解产生相似量的染色质然而，使用 Medimachine 分解的组织处理的染色质通常比使用 Dounce 匀浆器分解的组织处理的染色质具有更高的 IP 效率。强烈建议使用 Dounce 均质器来分解脑组织，因为 Medimachine 不能将脑组织充分分解成单细胞悬液。为获得最佳的 ChIP 结果，我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 µg 消化的交联染色质；因此，有些组织每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。

组织/细胞总染色质产量预期 DNA 浓度脾脏 20-30 µg 每 25 mg 组织 200-300 µg/ml 肝脏 10-15 µg 每 25 mg 组织 100-150 µg/ml 肾脏 8-10 µg 每 25 mg 组织 80-100 µg/ml 大脑 2-5 µg 每 25 mg 组织 20-50 µg/ml 心脏 2-5 µg 每 25 mg 组织 20-50 µg/ mlHeLa 10-15 µg 每 4 x 106 个细胞 100-150 µg/ml 附录 B：染色质消化的优化

将交联染色质 DNA 消化至 150-900 个碱基对长度的最佳条件在很大程度上取决于微球菌核酸酶与消化中使用的组织量或细胞数的比例。以下是确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的方案。

从 125 mg 制备交联细胞核组织或 2 X 107 个细胞（相当于 5 次 IP 制备），如第 I、II 和 III 部分所述。在第 III 部分的第 2 步后停止并按如下所述进行。将 100 µl 细胞核制备物转移到 5 个 1.5 ml微量离心管并置于冰上。将 3 µl 微球菌核酸酶原液添加至 27 µl1X 缓冲液 B + DTT（酶的 1:10 稀释度）。向步骤 2 中的 5 个试管中的每一个添加 0 µl、2.5 µl、5 µl、7.5 µl 或 10 µl 稀释的微球菌核酸酶，颠倒混合试管数次并在 37°C 下孵育 20 分钟并频繁混合。通过添加 10 µl 0.5 M EDTA 并将试管置于冰上停止每次消化。在微量离心机中在 4°C 下以 16,000 x g 离心 1 分钟沉淀细胞核并去除上清液。在 200 µl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬核沉淀。在冰上孵育 10 分钟。用几个脉冲对裂解物进行超声处理以破坏核膜。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可以通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定。使用 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/声波仪，在 3 组 20 秒脉冲后，HeLa 细胞核完全裂解，设置为设置 6，带有 1/8 英寸探头。另类ely，可以通过在Dounce匀浆器中将裂解物匀浆20次来裂解细胞核；然而，裂解可能不那么完整。通过在 4°C 下在微量离心机中以 9,400 x g 离心 10 分钟来澄清裂解物。将 50 µl 的每种超声裂解物转移到新的微量离心管中。向每 50 µl 样品中加入 100 µl无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl 和 2 µl RNAse A。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中加入 2 µl 蛋白酶 K。涡旋混合并孵育样品在 65°C 下处理 2 小时。从每个样品中取出 20 µl，并通过在带有 100 bp DNA 标记的 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳来确定 DNA 片段大小。观察哪种消化条件产生的 DNA 在所需的 150-900 范围内碱基对（1 至 5 个核小体）。使用此优化方案产生所需大小的 DNA 片段的稀释微球菌核酸酶的体积相当于微球菌体积的 10 倍应添加到一种免疫沉淀制备物（25 毫克分解的组织细胞或 4 X 106 个组织培养细胞）中以产生所需大小的 DNA 片段的核酸酶原液。例如，如果 5 µl 稀释的微球菌核酸酶在此实验方案中产生 150-900 个碱基对的 DNA 片段，则在第 III 部分的染色质消化过程中，应将 0.5 µl 微球菌核酸酶原液添加到一次免疫沉淀制备中。如果结果表明DNA 不在所需的大小范围内，然后重复优化方案，相应地调整每次消化中微球菌核酸酶的量。或者，可以改变消化时间以增加或减少 DNA 片段化的程度。附录 C：故障排除指南问题可能原因建议 1。消化染色质的浓度太低。添加到染色质消化中的细胞不足或细胞核在消化后未完全裂解。

如果染色质制备物的 DNA 浓度为接近 50 µg/ml，向每个 IP 添加额外的染色质以提供至少 5 µg/IP 并继续执行方案。

在交联之前对单独的细胞板进行计数以确定准确的细胞数和/或在超声处理前后在显微镜下观察细胞核以确认细胞核完全裂解。

2.染色质消化不足且片段太大（大于 900 bp）。

细胞可能过度交联。交联时间超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。

染色质消化中添加的细胞过多或微球菌核酸酶不足。

以固定时间执行时间进程甲醛浓度。将交联时间缩短至 10 分钟或更短。

在交联前对单独的细胞板进行计数以确定准确的细胞数，并参见附录 B 以优化染色质消化。

3 .染色质过度消化且片段太小（仅 150 bp 单核小体长度）。有限公司将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能会减少 PCR 定量过程中的信号，尤其是对于长度超过 150 bp 的扩增子。没有足够的细胞或添加到染色质消化中的微球菌核酸酶过多。在交联前对单独的细胞板进行计数，以确定准确的细胞数，有关染色质消化的优化，请参见附录 B。 4．输入 PCR 反应中没有产物或产物很少。

没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应或条件不是最佳的。

PCR 扩增区域可能跨越无核小体区域。

没有足够的染色质添加到 IP 或染色质过度消化。

在 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环数。

使用来自交联和纯化的 DNA 优化实验引物组的 PCR 条件消化的染色质。设计不同的引物组并将扩增子的长度减少到 150 bp 以下（参见 Se 中的引物设计建议第 VIII 节）。

为获得最佳 ChIP 结果，每个 IP 添加 5-10 µg 染色质。参见上面问题 1 和 3 的建议。

5．阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中没有产物。

IP 反应中加入的染色质或抗体不足或 IP 孵育时间太短。

Protein G beads 染色质洗脱不完全。

务必添加 5- 10 µg 染色质和 10 µl 抗体用于每个 IP 反应，并与抗体一起孵育过夜，并在添加蛋白 G 珠子后再孵育 2 小时。

从蛋白 G 珠子上洗脱染色质的最佳温度为 65° C 经常搅拌以保持珠子悬浮在溶液中。

6．阴性对照兔 IgG-IP 和阳性对照组蛋白 H3-IP PCR 反应中的产物量是相等的。

IP 反应中添加的染色质过多或不足。或者，IP 反应中添加了过多抗体。

PCR 反应中添加了过多 DNA 或扩增循环过多

向每个 IP 反应添加不超过 15 µg 染色质和 10 µl 组蛋白 H3 抗体。将每次 IP 的正常兔 IgG 的量减少至 1 µl。

在 PCR 反应中添加较少的 DNA 或减少 PCR 循环数。在 PCR 的线性扩增阶段分析 PCR 产物非常重要。否则无法准确测定起始DNA量的差异。

7．实验抗体-IP PCR 反应中没有产物。

没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应。

没有足够的抗体添加到 IP 反应。

抗体不适用于 IP。

添加将更多 DNA 加入 PCR 反应或增加扩增循环数。

通常，IP 反应中会添加 1 至 5 µg 范围内的抗体；但是，确切的量在很大程度上取决于单个抗体。

增加添加到 IP 的抗体量。寻找替代抗体来源。

201 年 12 月发布1

2022 年 4 月修订

方案 ID：82

染色质 IP

特定产品：SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (磁珠）#9005。

所需试剂

试剂包括：

甘氨酸溶液 (10X) #7005Buffer A (4X) #7006Buffer B (4X) #7007ChIP 缓冲液 (10X) #7008ChIP 洗脱缓冲液 ( 2X) #70095 M NaCl #70100.5 M EDTA #7011ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006DNA Binding Buffer #10007DNA Wash Buffer（使用前加入 4 倍体积的乙醇）#10008DNA Elution Buffer #10009DNA Purification Columns #10010Protease Inhibitor Cocktail (200X) # 7012RNAse A (10 mg/ml) #7013Micrococcal Nuclease (2000 gel units/µl) #10011Proteinase K (20 mg/ml) #10012SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015Histone H3 (D2B12 ) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620Normal Rabbit IgG #2729DTT (Dithiothreitol) #7016

不包括试剂：

Magnetic Separation Rack #7017 / 14654Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2（无菌）#9872Nuclease-free Water #12931Ethanol (96-100%)Formaldehyde (37% Stock)Taq DNA PolymerasedNTP MixI。组织交联和样品制备

采集组织时，从样品中去除不需要的物质，例如脂肪和坏死物质。然后可以立即对组织进行处理和交联，或在干冰上冷冻以备后用。为获得最佳染色质产量和 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用 25 mg 组织。染色质产量确实因组织类型而异，有些组织每次免疫沉淀可能需要超过 25 mg。有关不同类型组织的预期染色质产量的更多信息，请参阅附录 A。应处理一份额外的染色质样品以进行染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。

开始之前：取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) 和 10X 甘氨酸溶液。确保 PIC 完全解冻d.每 25 mg 待处理组织准备 3 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 15 µl 200X PIC 并置于冰上。每 25 mg 待处理组织准备 45 µl 37% 甲醛并在室温下保存.使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。交联称重新鲜或冷冻的组织样本。每个要执行的 IP 使用 25 毫克的组织。将组织样本放入 60 毫米或 100 毫米的盘子中，并使用干净的手术刀或剃须刀片切碎。把菜放在冰上。保持组织低温以避免蛋白质降解很重要。将切碎的组织转移到 15 ml 锥形管中。向锥形管中每 25 mg 组织添加 1 ml PBS + PIC。要将蛋白质交联到 DNA，添加 45 µl 37每 1 ml PBS + PIC 的甲醛百分比，并在室温下摇晃 20 分钟。最终甲醛浓度为 1.5%。通过每 1 ml PBS + PIC 添加 100 µl 10X 甘氨酸来停止交联，并在室温下混合 5 分钟。离心 tis在 4°C 的台式离心机中以 1,500 rpm 的转速离心 5 分钟。去除上清液，每 25 mg 组织用 1 ml PBS + PIC 洗涤一次。在台式离心机中以 1,500 rpm 的转速在 4°C 下重复离心 5 分钟。去除上清液，每 25 mg 组织在 1 ml PBS + PIC 中重悬组织并储存在冰上。使用 Medimachine（B 部分）或 Dounce 匀浆器（C 部分）将组织分解成单细胞悬浮液。B.使用 BD Biosciences 的 Medimachine 进行组织分解（部件号 340587）切掉 1000 µL 移液器尖端的末端以扩大用于转移组织块的开口。将重悬于 PBS + PIC 中的 1 ml 组织转移到 50 mm 的顶部腔室中medicone（部件号 340592）。根据制造商的说明研磨组织 2 分钟。使用 1 ml 注射器和 18 号钝针从 medicone 的底部室收集细胞悬浮液。将细胞悬液转移到 15 ml 锥形管中并置于冰上。重复步骤 2 至 4，直到所有组织都处理完o 均质悬浮液。如果需要更多研磨，请向组织中添加更多 PBS + PIC。重复步骤 2 至 5，直到所有组织都被研磨成均匀的悬浮液。通过显微镜（可选）检查单细胞悬浮液。在台式离心机中于 4°C 下以 1,500 rpm 的速度离心细胞 5 分钟。从细胞中去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。C。使用 Dounce 匀浆器进行组织分解将重新悬浮在 PBS + PIC 中的组织转移到 Dounce 匀浆器中。用 20-25 次冲程分解组织块。通过显微镜检查单细胞悬浮液（可选）。将细胞悬浮液转移到 15 ml 锥形管中，并在台式离心机中以 1,500 rpm 的转速在 4°C 下离心 5 分钟。从细胞中去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第三部分）.II.细胞培养物交联和样品制备

为获得最佳 ChIP 结果，每个细胞使用大约 4 X 106 个细胞进行免疫沉淀。对于 HeLa 细胞，这相当于 15 cm 培养皿的一半，其中含有在 20 ml 生长培养基中 90% 汇合的细胞。应处理一个额外的样本用于染色质消化和浓度分析（第 IV 部分）。在实验中加入一盘额外的细胞，用于使用血细胞计数器测定细胞数量。

开始前取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012 和 10X 甘氨酸溶液 #7005。确保 PIC 完全解冻。准备 2 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 10 µl 200X PIC 每 15 cm 待处理的培养皿并置于冰上。每 15 cm 培养皿准备 40 ml PBS 待处理并置于冰上。准备 540 µl 37%每 15 cm 培养皿中的甲醛要处理并保持在室温下。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。要将蛋白质与 DNA 交联，请向每个 15 厘米的培养物中添加 540 微升 37% 的甲醛含有 20 毫升培养基的培养皿。短暂旋转以混合并在室温下孵育 10 分钟。最终甲醛浓度为 1%。添加甲醛可能会导致培养基颜色发生变化。将 2 ml 10X 甘氨酸添加到每个含有 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿中，短暂旋转以混合，并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能会导致培养基颜色发生变化。对于悬浮细胞，将细胞转移到 50 ml 锥形管中，在台式离心机中 4°C 下以 1,500 rpm 离心 5 分钟，然后用 20 ml 冰洗涤沉淀两次冷 PBS。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。对于贴壁细胞，去除培养基并用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞两次，每次完全去除培养皿中的洗涤液。加入 2 ml 冰-冷 PBS + PIC 到每个 15 厘米的培养皿中。将细胞刮入冷缓冲液中。将所有培养皿中的细胞合并到一个 15 ml 锥形管中。以 1,500 rpm 的速度将细胞离心台式离心机在 4°C 下离心 5 分钟。去除上清液并立即继续细胞核制备和染色质消化（第 III 部分）。细胞核制备和染色质消化

一次免疫沉淀制备（IP 制备）定义为 25 mg 分解组织或 4 x 106 个组织培养细胞。

开始前取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。确保在使用前完全解冻。

准备 1 M DTT（192.8 mg DTT #7016 + 1.12 ml dH2O）。确保 DTT 晶体完全溶解。

重要提示：一旦溶解，将 1M DTT 储存在 -20°C。

取出并加热 10X ChIP Buffer #7008，确​​保 SDS 完全溶解.准备 1 ml 1X 缓冲液 A（250 µl 4X 缓冲液 A #7006 + 750 µl 水）+ 0.5 µl 1M DTT + 5 µl 200X PIC 每次 IP 制备并置于冰上。准备 1.1 ml 1X 缓冲液 B（275 µl 4X 缓冲液 B #7007 + 825 µl 水) + 0.55 µl 1M DTT 每次 IP 准备并置于冰上。准备 100 µl 1X ChIP 缓冲液（10 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 90 µl 水）+ 0.5 µl 200X PIC 每次 IP 制备并置于冰上。将细胞重悬于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 A + DTT + PIC 每次 IP 制备.在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟通过倒置管混合。在 4°C 的台式离心机中以 3,000 rpm 离心 5 分钟以沉淀细胞核。每次 IP 制备时，去除上清液并在 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。重复离心，去除上清液，并在每次 IP 制备时在 100 µl 1X 缓冲液 B + DTT 中重悬沉淀。将样品转移到 1.5 ml 微量离心管中，每管总量不超过 1 ml。每次 IP 制备添加 0.5 µl Micrococcal Nuclease #10011，倒置管数次混合，并在 37°C 下孵育 20 分钟，并频繁混合以消化 DNA到大约 150-900 bp 的长度。每 3 至 5 分钟颠倒混合一次。将 DNA 消化至最佳长度所需的微球菌核酸酶的量可能需要根据个体经验确定l 组织和细胞系（见附录B）。每 4 x 106 个细胞用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化的 HeLa 细胞核和每 25 mg 组织用 0.5 µl 微球菌核酸酶消化的小鼠肝组织得到适当长度的 DNA 片段。通过每次免疫沉淀制备添加 10 µl 0.5 M EDTA #7011 来停止消化并将试管置于冰上。在 4°C 下在微量离心机中以 13,000 rpm 离心 1 分钟以沉淀细胞核，然后去除上清液。根据 IP 制备在 100 µl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬核沉淀，并在冰上孵育 10 分钟。每个 1.5 ml 微量离心管最多可处理 500 µl 裂解物，并使用多个脉冲来破坏核膜。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可以通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定。使用 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/Son 在 3 组 20 秒脉冲后完全裂解 HeLa 细胞核icator 在设置 6 与 1/8 英寸的探针。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不完全。通过在 4°C 下在微量离心机中以 10,000 rpm 离心 10 分钟来澄清裂解物。将上清液转移到新管中。这是交联染色质制剂，应在 -80°C 下保存直至进一步使用。取出 50 µl 染色质制备物，用于分析染色质消化和浓度（第 IV 部分）。染色质消化和浓缩分析（推荐步骤）向 50 µl 染色质样品（来自第 III 部分中的步骤 9）添加 100 µl 无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl #7010 和 2 µl RNAse A #7013。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样品中添加 2 µl 蛋白酶 K。涡旋混合并在 65°C 下孵育样品 2 小时。使用 DNA 纯化离心纯化样品中的 DNA列描述编于第 VII 节。纯化 DNA 后，取出 10 µl 样品，并在带有 100 bp DNA 标记的 1% 琼脂糖凝胶上通过电泳确定 DNA 片段大小。 DNA 应被消化至大约 150-900 bp 的长度（1 至 5 个核小体）。要确定 DNA 浓度，请将 2 µl 纯化的 DNA 转移到 98 µl 无核酸酶的水中进行 50 倍稀释并读取 OD260。以 µg/ml 为单位的 DNA 浓度为 OD260 x 2,500。理想情况下，DNA 浓度应介于 50 和 200 µg/ml 之间。

注意：为获得最佳的 ChIP 结果，染色质的大小和浓度是否合适至关重要。染色质的过度消化可能会减少 PCR 定量中的信号。染色质消化不足可能导致背景信号增加和分辨率降低。在 IP 中添加的染色质太少可能会导致 PCR 定量中的信号减弱。染色质消化优化方案见附录 B.

V。铬atin 免疫沉淀

为获得最佳 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 µg 消化的交联染色质（如第 IV 部分中所确定）。这应该大致相当于从 25 mg 分解组织或 4 x 106 个组织培养细胞中制备的 100 µl IP 制备物。通常，在添加抗体之前，将 100 µl 消化的染色质稀释到 400 µl 1X ChIP 缓冲液中。但是，如果每次 IP 需要超过 100 µl 的染色质，则交联染色质制备物无需按如下所述进行稀释。抗体可直接添加到未稀释的染色质制剂中，用于染色质复合物的免疫沉淀。

开始前取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。取出并加热 10X ChIP Buffer #7008，确​​保 SDS 完全溶解。解冻消化的染色质制备物（来自第 III 部分的第 9 步）并置于冰上。准备低盐洗涤：每次免疫沉淀 3 ml 1X ChIP 缓冲液（300 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 2.7 ml 水）。在室温下储存直至使用。准备高盐洗涤液：每次免疫沉淀 1 ml 1X ChIP 缓冲液（100 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 900 µl 水）+ 70 µl 5M NaCl #7010。在室温下储存直至使用。在一个试管中，准备足够的 1X ChIP 缓冲液，用于将消化的染色质稀释成所需数量的免疫沉淀：400 µl 1X ChIP 缓冲液（40 µl 10X ChIP 缓冲液 + 360 µl 水）+ 2 µl每次免疫沉淀 200X PIC。确定免疫沉淀次数时，请记住包括阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620 和阴性对照 Normal Rabbit IgG antibody #2729 样品。将混合物置于冰上。向准备好的 1X ChIP 缓冲液中添加相当于 100 µl（5 至 10 µg 染色质）的消化交联染色质制剂（来自第 III 部分中的第 9 步）每免疫沉淀。例如，对于 10 次免疫沉淀，准备一个含有 4 ml 1X ChIP 缓冲液（400 µl 10X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 µl 200X PIC + 1 ml 消化染色质制剂的试管。取出 10 µl 稀释染色质样品并转移到微量离心管。这是您的 2% Input Sample，可在 -20°C 下保存直至进一步使用（第 VI 部分中的步骤 1）。对于每次免疫沉淀，将 500 µl 稀释的染色质转移到 1.5 ml 微量离心管中并添加免疫沉淀抗体.每个 IP 所需的抗体量各不相同，应由用户确定。对于阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620，向 IP 样品中添加 10 µl。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729，将 1 µl（1 µg）到 2 µl（2 µg）添加到 IP 样品中。将 IP 样品在 4°C 下旋转孵育 4 小时至过夜。

注意：Cell Signaling Technology 的大多数抗体选择每个 IP 样本最终在 1 到 2 微克之间。如果有多个浓度不同的样品，最好将阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。

通过轻轻涡旋重悬 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006。立即向每个 IP 反应中添加 30 µl 蛋白 G 磁珠，并在 4°C 下旋转孵育 2 小时。通过将试管置于磁力分离架 #7017 中，在每次免疫沉淀中沉淀蛋白 G 磁珠。等待 1 至 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。通过向磁珠中加入 1 ml 低盐洗涤液来清洗 G 蛋白磁珠，并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。再重复步骤 6 和 7 两次，共进行 3 次低盐洗涤。将 1 ml 高盐洗涤液加入磁珠中，并在 4°C 下旋转孵育 5 分钟。通过将磁选管离子架。等待 1 至 2 分钟使溶液变澄清，然后小心去除上清液。立即进入第 VI.VI 节。从抗体/蛋白 G 磁珠洗脱染色质和逆转交联开始前取出 2X ChIP 洗脱缓冲液 #7009 并在 37°C 水浴中加热，确保 SDS 在溶液中。将水浴或热混合器设置为 65°C。为每次免疫沉淀和 2% 输入样品准备 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液（75 µl 2X ChIP 洗脱缓冲液 #7009 + 75 µl 水）。将 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液添加到 2% 输入样品管中并备用在室温下进行第 6 步。向每个 IP 样品中添加 150 µl 1X ChIP 洗脱缓冲液。在 65°C 下轻轻涡旋（1,200 rpm）从抗体/蛋白 G 磁珠中洗脱染色质 30 分钟。恒温器最适合此步骤。或者，洗脱可以在室温下旋转进行，但可能不那么完整。沉淀蛋白 G 磁珠ds 通过将管子放在磁力分离架上并等待 1 到 2 分钟以使溶液澄清。小心地将洗脱的染色质上清液转移到新管中。对于所有管子，包括来自步骤 1 的 2% 输入样品，反向交联添加 6 µl 5M NaCl 和 2 µl Proteinase K #10012，并在 65°C 下孵育 2 小时。该孵育可以延长过夜。立即进行第七部分。或者，样品可以储存在 -20°C。但是，为避免形成沉淀，请确保在添加 DNA Binding Buffer #10007 之前将样品加热至室温（第 VII 部分，步骤 1）。VII。使用离心柱纯化 DNA 开始之前在使用前将 24 ml 乙醇 (96-100%) 添加到 DNA Wash Buffer #10008 中。此步骤只需在第一组 DNA 纯化之前执行一次。从第 V 部分中取出每个 DNA 样本的 DNA 纯化收集管 #10010。向每个 DNA 样本中添加 750 µl DNA Binding Buffer #10007 并短暂涡旋。5 D 的体积每 1 体积样品应使用 NA 结合缓冲液。将步骤 1 中的每个样品 450 µl 转移至收集管中的 DNA 离心柱。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并丢弃液体。更换收集管中的离心柱。将步骤 1 中每个样品剩余的 450 µl 转移到收集管中的离心柱中。重复步骤 3 和 4。将 750 µl DNA Wash Buffer #10008 添加到收集管中的离心柱。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并弃去液体。更换收集管中的离心柱。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒。丢弃收集管和液体。保留离心柱。将 50 µl DNA Elution Buffer #10009 添加到每个离心柱中，然后放入干净的 1.5 ml 微量离心管中。在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 30 秒以洗脱 DNA.Rem弃去 DNA 离心柱。洗脱液现在是纯化的 DNA。样品可以储存在-20°C。VIII。通过 PCR 对 DNA 进行定量建议使用带过滤头的移液器吸头以最大限度地降低污染风险。试剂盒中包含的对照引物专用于人或小鼠 RPL30 基因 (#7014 + #7015)，可用于标准 PCR 或定量实时定量时间 PCR。如果用户对其他物种进行 ChIP，建议用户针对 DNA 设计合适的特异性引物并确定最佳 PCR 条件。建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度地降低非特异性 PCR 产物的风险。PCR 引物选择很关键。引物设计应严格遵守以下标准：引物长度：24 个核苷酸最佳 Tm：60°CO 最佳 GC：50% 扩增子大小：150 至 200 bp（用于标准 PCR）80 至 160 bp（用于实时定量 PCR）标准 PCR 方法 将 0.2 ml PCR 管的适当数量标记为 sam 的数量要分析的问题。这些应包括 2% 输入样本、阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本，以及一个没有 DNA 的试管以控制 DNA 污染。向每个试管中加入 2 µl 适当的 DNA 样本。准备一个主反应混合物如下所述，确保为两个额外的管添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个反应管中加入 18 µl 预混液。1 个 PCR 反应的试剂体积 (18 µl) 无核酸酶 H2O 12.5 µl10X PCR 缓冲液 2.0 µl4 mM dNTP 混合物 1.0 µl5 µM RPL30 引物 2.0 µlTaq DNA 聚合酶 0.5 µl 开始以下 PCR 反应程序： A。初始变性 95°C 5 分钟。变性 95°C 30 秒。退火 62°C 30 秒。延伸 72°C 30 秒。重复步骤 b-d 总共 34 个周期。最终延伸 72°C 5 minRemove 10 µl of each PCR product for analysis by 2% agarose gel or 10% polyacrylamide gel electrophoresis wi一个 100 bp 的 DNA 标记。人 RPL30 #7014 的 PCR 产物的预期大小为 161 bp，小鼠 RPL30 #7015 的预期大小为 159 bp。实时定量 PCR 方法标记与要使用的 PCR 机器型号兼容的适当数量的 PCR 管或 PCR 板。 PCR 反应应包括阳性对照组蛋白 H3 样本、阴性对照正常兔 IgG 样本、不含用于控制污染的 DNA 的试管，以及连续稀释的 2% 输入染色质 DNA（未稀释、1:5、1:25 , 1:125) 以创建标准曲线并确定扩增效率。将 2 µl 适当的 DNA 样本添加到 PCR 板的每个试管或孔中。如下所述制备主反应混合物。为两个额外的反应添加足够的试剂以弥补体积损失。向每个 PCR 反应管或孔中加入 18 µl 反应混合物。1 个 PCR 反应的试剂体积 (18 µl) 无核酸酶 H2O 6 µl5 µM RPL30 引物 2 µlSYBR-Green 反应混合物 10 µl启动以下PCR反应程序：a．初始变性 95°C 3 分钟。变性 95°C 15 秒。退火和延伸：60°C 60 秒。重复步骤 b 和 c，共进行 40 个循环。

使用实时 PCR 仪提供的软件分析定量 PCR 结果。或者，可以使用百分比输入法和下面显示的等式手动计算 IP 效率。使用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表示为总输入染色质的百分比。

输入百分比 = 2% x 2(C[T] 2% 输入样本 - C[T] IP 样本)

C[T] = CT = PCR反应的阈值循环

IX. NG 测序文库构建

使用该试剂盒制备的免疫富集 DNA 样本可直接与 ChIP-seq 兼容。对于下游 NG 测序 DNA 文库构建，请使用与您的下游测序平台兼容的 DNA 文库制备方案或试剂盒。对于 Illumina® 平台上的测序，我们建议nd DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 及其相关的标签引物 Multiplex Oligos for Illumina®（单标签引物）（ChIP-seq, CUT&RUN）#29580 或 Multiplex Oligos for Illumina®（双重标签） Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538。

建议

对于转录因子或辅因子 ChIP-seq，使用至少 5 ng ChIP-enriched DNA 和扩增使用 10 个 PCR 循环连接适配器连接的 DNA。对于总组蛋白和组蛋白修饰或输入样本，从 50 ng ChIP 富集 DNA 开始，使用 6 个 PCR 循环扩增连接适配器连接的 DNA。对于 ChIP- 的文库构建富集所有目标类型的 DNA，在不选择大小的情况下对接头连接的 DNA 进行清理。DNA 文库构建后，使用安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒（Agilent Technologies，Cat#）检查 DNA 文库是否存在接头二聚体（~140 bp） G2938-90322)，或使用 50-100 ng DNA 在 2% 琼脂糖 T 上进行琼脂糖凝胶电泳AE凝胶。如果 DNA 文库中存在接头二聚体，则重复 PCR 扩增材料的清理。文库的质量也可以使用 qPCR 和针对已知阳性和阴性目标位点的引物组来确认。阳性引物对仍应提供与比较相同的高信号如在对 ChIP 富集的 DNA 的原始 qPCR 分析中所见，为阴性引物。在最终清理和质量检查后，准备 2-10 nM 的最终纯化文库样本以进行高通量测序。附录 A：预期染色质产量

收获杂交时来自组织样本的连锁染色质，染色质的产量在不同组织类型之间可能存在显着差异。右表提供了 25 mg 组织与 4 x 106 HeLa 细胞相比的预期染色质产量范围，以及预期的 DNA 浓度，如方案第 IV 节中所确定。对于每种组织类型，使用Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器产生相似数量的染色质。H然而，从使用 Medimachine 解聚的组织中处理的染色质通常比从使用 Dounce 匀浆器解聚的组织中处理的染色质具有更高的 IP 效率。强烈建议使用 Dounce 均质器来分解脑组织，因为 Medimachine 不能将脑组织充分分解成单细胞悬液。为获得最佳的 ChIP 结果，我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 µg 消化的交联染色质；因此，有些组织每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。

组织/细胞总染色质产量预期 DNA 浓度脾脏 20-30 µg/25 mg 组织 200-300 µg/ml 肝脏 10-15 µg/25 mg 组织 100- 150 µg/ml 肾脏 每 25 mg 组织 8-10 µg 80-100 µg/mlBrain 每 25 mg 组织 2-5 µg 20-50 µg/ml 心脏 每 25 mg 组织 2-5 µg 20-50 µg/mlHeLa 10-15 µg每 4 x 106 个细胞 100-150 µg/ml 附录 B：Optim染色质消化化

将交联染色质 DNA 消化至 150-900 个碱基对长度的最佳条件在很大程度上取决于微球菌核酸酶与消化中使用的组织量或细胞数的比例。以下是确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的方案。

从 125 mg 组织或 2 X 107 个细胞（相当于 5 个 IP 制备）中制备交联细胞核，如第 I 部分所述、II 和 III。在第 III 部分的第 2 步后停止并按如下所述进行。将 100 µl 细胞核制备物转移到 5 个单独的 1.5 ml 微量离心管中并置于冰上。将 3 µl 微球菌核酸酶原液添加到 27 µl 1X 缓冲液中B + DTT（酶的 1:10 稀释度）。向步骤 2 中的 5 个试管中的每一个添加 0 µl、2.5 µl、5 µl、7.5 µl 或 10 µl 稀释的微球菌核酸酶，颠倒试管数次混匀并在 37°C 下与 fr 孵育 20 分钟等量混合。通过添加 10 µl 0.5 M EDTA 并将试管置于冰上来停止每次消化。在 4°C 下在微量离心机中以 13,000 rpm 离心 1 分钟以沉淀细胞核，然后去除上清液。在 200 µl 1X ChIP 中重悬细胞核缓冲区+图片。在冰上孵育 10 分钟。用几个脉冲对裂解物进行超声处理以破坏核膜。在脉冲之间将样品在湿冰上孵育 30 秒。细胞核完全裂解所需的最佳条件可以通过在超声处理前后在光学显微镜下观察细胞核来确定。使用 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/声波仪，在 3 组 20 秒脉冲后，HeLa 细胞核完全裂解，设置为设置 6，带有 1/8 英寸探头。或者，可以通过在 Dounce 匀浆器中将裂解物匀浆 20 次来裂解细胞核；然而，裂解可能不完全。通过在 4°C 下在微量离心机中以 10,000 rpm 离心 10 分钟来澄清裂解物。转移 50 µl 的每个超声裂解物到新的微量离心管中。向每个 50 µl 样品中添加 100 µl 无核酸酶水、6 µl 5 M NaCl 和 2 µl RNAse A。涡旋混合并在 37°C 下孵育样品 30 分钟。向每个 RNAse A 消化的样本，加入 2 µl 蛋白酶 K。涡旋混合并在 65°C 下孵育样本 2 小时。从每个样本中取出 20 µl，并在带有 100 bp DNA 标记的 1% 琼脂糖凝胶上通过电泳确定 DNA 片段大小。观察哪个多种消化条件可产生 150-900 个碱基对（1 至 5 个核小体）所需范围内的 DNA。使用此优化方案产生所需大小的 DNA 片段的稀释微球菌核酸酶体积相当于应添加到一种免疫沉淀制备物（25 毫克分解组织细胞或 4 X 106 组织培养物）中的微球菌核酸酶原液体积的 10 倍细胞）以产生所需大小的 DNA 片段。例如，如果 5 µl 稀释的 Micrococcal Nuclease 产生 DNA fra在本实验方案中加入 150-900 个碱基对，然后在第 III 节染色质消化过程中，将 0.5 µl 原液微球菌核酸酶添加到一个 IHC 制备物中。如果结果表明 DNA 不在所需的大小范围内，则重复优化方案，相应地调整每次消化中微球菌核酸酶的量。或者，可以改变消化时间以增加或减少 DNA 片段化的程度。附录 C：故障排除指南问题可能原因建议 1。消化染色质的浓度太低。添加到染色质消化中的细胞不足或细胞核在消化后未完全裂解。

如果染色质制剂的 DNA 浓度接近 50 µg/ml，则向每个 IP 添加额外的染色质以提供至少 5 µg/IP 并继续执行方案。

对单独的细胞板进行计数在交联之前确定准确的细胞数量和/或在显微镜下观察细胞核超声处理后确认细胞核完全裂解。

2．染色质消化不足且片段太大（大于 900 bp）。

细胞可能过度交联。交联时间超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。

染色质消化中添加的细胞过多或微球菌核酸酶不足。

以固定时间执行时间进程甲醛浓度。将交联时间缩短至 10 分钟或更短。

在交联前对单独的细胞板进行计数以确定准确的细胞数，并参见附录 B 以优化染色质消化。

3 .染色质过度消化且片段太小（仅 150 bp 单核小体长度）。将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能会在 PCR 定量期间减弱信号，尤其是对于长度大于 150 bp 的扩增子。没有足够的细胞或添加到染色质消化中的微球菌核酸酶过多。算一个单独的pl在交联前对细胞进行消化，以确定准确的细胞数，染色质消化的优化见附录B。 4．输入 PCR 反应中没有产物或产物很少。

没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应或条件不是最佳的。

PCR 扩增区域可能跨越无核小体区域。

没有足够的染色质添加到 IP 或染色质过度消化。

在 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环数。

使用来自交联和纯化的 DNA 优化实验引物组的 PCR 条件消化的染色质。设计不同的引物组并将扩增子的长度减少到 150 bp 以下（参见第 VIII 节中的引物设计建议）。

为获得最佳的 ChIP 结果，每个 IP 添加 5-10 µg 染色质。参见上面问题 1 和 3 的建议。

5．阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中没有产物。

IP 反应中添加的染色质或抗体不足或IP 孵育时间太短。

Protein G beads 染色质洗脱不完全。

确保在每个 IP 反应中添加 5-10 µg 染色质和 10 µl 抗体，并且与抗体一起孵育过夜，并在添加蛋白 G 珠子后再孵育 2 小时。

在 65°C 下从 Protein G 珠子上洗脱染色质是最佳的，并经常混合以保持珠子悬浮在溶液中。

6。阴性对照兔 IgG-IP 和阳性对照组蛋白 H3-IP PCR 反应中的产物量是相等的。

IP 反应中添加的染色质过多或不足。或者，IP 反应中添加了过多的抗体。

PCR 反应中添加了过多的 DNA 或扩增循环过多。

添加的染色质不超过 15 µg 和 10微升组蛋白 H3 抗体用于每个 IP 反应。将每次 IP 的正常兔 IgG 的量减少至 1 µl。

在 PCR 反应中添加较少的 DNA 或减少 PCR 循环数。这是非常我重要的是在 PCR 的线性扩增阶段分析 PCR 产物。否则无法准确测定起始DNA量的差异。

7．实验抗体-IP PCR 反应中没有产物。

没有足够的 DNA 添加到 PCR 反应。

没有足够的抗体添加到 IP 反应。

抗体不适用于 IP。

添加将更多 DNA 加入 PCR 反应或增加扩增循环数。

通常，IP 反应中会添加 1 至 5 µg 范围内的抗体；但是，确切的量在很大程度上取决于单个抗体。

增加添加到 IP 的抗体量。寻找替代抗体来源。

2011 年 12 月发布

2022 年 4 月修订

方案 ID：1184

CUT&RUN 方案！这 ！表示协议中关于基于正在执行的 CUT&RUN 反应数量变化的体积变化的重要步骤。！！这个！！表示一个重要的步骤p 在继续之前稀释缓冲区。安全停止这是协议中的安全停止点，如果停止是必要的。细胞和组织制备

对于大多数细胞类型，活细胞可用于 CUT&RUN 检测以产生组蛋白、转录因子和辅因子的稳健富集。对于某些脆弱或对伴刀豆球蛋白 A 敏感的细胞类型，一种轻型细胞固定有助于保存细胞并使其保持完整。此外，如果使用新鲜细胞未观察到强信号，固定可能有助于促进低丰度和/或弱结合转录因子和辅助因子的富集。请注意，细胞的过度固定会抑制 CUT&RUN 分析。

我们的 CUT&RUN 分析适用于范围广泛的细胞或组织输入。如协议中所定义，一次 CUT&RUN 反应可包含 5,000 至 250,000 个细胞或 1 至 5 mg 的组织。整个协议中使用的缓冲体积不需要根据细胞数量或 t 进行调整每个反应的问题，只要它在这个范围内。当有指示时，缓冲液体积确实需要根据正在执行的反应数量按比例增加。如果可能，我们建议每次反应使用 100,000 个细胞或 1 mg 组织。如果细胞数量有限，我们建议每次反应至少使用 5,000 至 10,000 个细胞进行组蛋白修饰，每次反应至少使用 10,000 至 20,000 个细胞进行转录因子或辅助因子。

注意：建议用于细胞透化的毛地黄皂苷的量是过量并且应该足以透化大多数细胞系和组织类型。然而，并非所有细胞系和组织都对毛地黄皂苷表现出相同的敏感性。如果您的特定细胞系或组织不适用于推荐的洋地黄皂苷浓度，您可以按照附录 A 中提供的方案优化条件。洋地黄皂苷处理应导致 >90% 的细胞群透化。

A.活细胞制备前rting:

!所有缓冲液体积应根据正在执行的 CUT&RUN 反应的数量按比例增加。

取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 和 100X Spermidine #27287。确保两者都完全解冻。准备 1X 洗涤缓冲液（每个细胞系 2 ml，每个反应或输入样品额外 100 µl）。例如，要制备 2.5 ml 1X 洗涤缓冲液，添加 250 µl 10X Wash Buffer #31415 + 25 µl 100X Spermidine #27287 + 12.5 µl 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 + 2212.5 µl Nuclease-free Water #12931。将其平衡至室温以最大程度地减少对细胞的压力。

注意：应在室温下连续执行活细胞（无固定）制备步骤，以最大程度地减少对细胞的压力。为尽量减少 DNA 碎片，避免在重悬过程中剧烈涡旋和空化样品。在为 CUT&RUN 准备活细胞时，我们建议准备 Concanavalin A Beads（部分II，准备细胞之前的步骤 1 至 5)，以尽量减少细胞在珠制备过程中停留的时间。活化的珠子可以储存在冰上直到准备使用。

在室温下收获新鲜的细胞培养物以尽量减少对细胞的压力。为每个反应收集 5,000 到 100,000 个细胞，并为输入样本额外收集 5,000 到 100,000 个细胞。确保包含阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 和阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 的反应。

注意：对于贴壁细胞，首先需要使用胰蛋白酶将细胞从培养皿中分离出来，并用至少 3 倍体积的组织培养基中和。我们不建议从培养皿中刮下细胞，因为这会对细胞造成压力甚至裂解。应使用血细胞计数器或其他细胞计数器对细胞进行计数，以确保用于实验的细胞数量正确。

离心机l 在室温下以 600 x g 悬浮 3 分钟并去除液体。

注意：使用低细胞数（<100,000 个总细胞）的挑战在于，离心后的细胞沉淀物并不总是肉眼可见，这使得它在洗涤步骤中容易丢失细胞。因此，当处理低细胞数时，我们建议跳过下面的第 3 至 5 步洗涤步骤。 Concanavalin A 珠子与细胞的结合在结合反应中可以耐受 40% 的细胞培养基。因此，在步骤 2 中对细胞悬浮液进行初始离心后，可以去除大部分上清液，每个反应留下 ≤40 µl 细胞培养基。然后在第 6 步中，向细胞悬液中添加足够的 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC），使每次反应的总体积达到 100 µl。

在 1 ml 的 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）中重悬细胞沉淀在室温下轻轻上下移液。在室温下以 600 x g 离心 3 分钟并去除液体.重复步骤 3 和 4 一次，再次洗涤细胞沉淀。对于每个反应或输入样品，添加 100 µl 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC），轻轻上下吹打重悬细胞沉淀。转移将 100 µl 细胞放入新试管中，并在 4°C 下储存直至第 V 部分。这是输入样本。

注意：输入样本将在后面的方案中在 55°C 下孵育，因此建议使用安全锁 1.5 ml 试管以减少孵育过程中的蒸发。

立即进行第 II.B 部分。固定细胞制备

注意：固定细胞制备需要以下试剂且不包含在该试剂盒中：37% 甲醛或 16% 甲醛无甲醇 #12606、Glycine Solution (10X) #7005 和 10% SDS解决方案 #20533。

开始之前：

！所有缓冲液体积应根据正在执行的 CUT&RUN 反应的数量按比例增加。

取出并加热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 #7012 和 100X 亚精胺 #27287。确保两者都完全解冻。准备 1X 洗涤缓冲液（每个细胞系 2 ml，每个反应或输入样品额外 100 µl）。例如，要制备 2.5 ml 1X 洗涤缓冲液，添加 250 µl 10X Wash Buffer #31415 + 25 µl 100X Spermidine #27287 + 12.5 µl 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 + 2212.5 µl Nuclease-free Water #12931。将其平衡至室温以最大程度地减少对细胞的压力。每 1 毫升待处理的细胞悬液准备 2.7 微升 37% 甲醛或 6.25 微升 16% 甲醛无甲醇 #12606 并保持在室温下。使用未超过制造商有效期的新鲜甲醛。为每个抗体/MNase 反应收集 5,000 至 100,000 个细胞，并为输入样本额外收集 5,000 至 100,000 个细胞。确保包含阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 和阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP&re 的反应G; Isotype Control (CUT&RUN) #66362。

注意：对于贴壁细胞系，首先需要使用胰蛋白酶将细胞从培养皿中分离出来，并用至少 3 倍体积的培养基中和。我们不建议从培养皿中刮下细胞，因为这会对细胞产生压力，甚至会裂解细胞。应使用血细胞计数器或其他细胞计数器对细胞进行计数，以确保实验中使用的细胞数量正确。

每 1 ml 添加 2.7 µl 37% 甲醛或 6.25 µl 16% 甲醛无甲醇 #12606细胞悬浮液达到最终浓度为 0.1% 的甲醛。旋转试管以混合并在室温下孵育 2 分钟。通过每 1 ml 固定细胞悬液添加 100 µl 甘氨酸溶液 (10X) #7005 来停止交联。旋转试管以混合并在室温下孵育 5 分钟。在 4°C 下以 3,000 x g 离心细胞悬浮液 3 分钟，然后去除液体。立即进行第 5 步。（安全停止）或者，固定细胞沉淀 may 在使用前可在 -80°C 下保存长达 6 个月。

注意：使用低细胞数（<100,000 个总细胞）的挑战在于，离心后的细胞沉淀物并不总是肉眼可见，这使得它在洗涤步骤中容易丢失细胞。在这种情况下，我们不建议冷冻细胞沉淀。此外，在处理这些低细胞数时，我们建议跳过下面的第 5 至 7 步洗涤步骤。 Concanavalin A 珠子与细胞的结合在结合反应中可以耐受 40% 的细胞培养基。因此，在第 4 步中对细胞悬浮液进行初始离心后，可以去除大部分上清液，每个反应留下 ≤40 µl 细胞培养基。然后在第 8 步中，向细胞悬液中添加足够的 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC），使每次反应的总体积达到 100 µl。

在 1 ml 的 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）中重悬细胞沉淀通过轻轻上下吹打。在 4° 下以 3,000 x g 离心 3 分钟C 并去除液体。重复步骤 5 和 6 一次，再次洗涤细胞沉淀。对于每个反应或输入样品，添加 100 µl 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）并通过轻轻吹打重悬细胞沉淀将 100 µl 细胞转移到一个新试管中，并在 4°C 下储存直至第 V 部分。这是输入样本。

注意：输入样本将在后面的实验方案中在 55°C 下孵育，因此建议使用 safe-lock 1.5 ml 试管以减少孵育过程中的蒸发。

立即进行第 II.C 部分。组织样品制备

对于大多数组织类型，1 mg 轻微固定的组织（0.1% 甲醛，2 分钟）可以产生组蛋白、转录因子和辅助因子的稳健富集。组蛋白修饰的富集不需要甲醛固定。然而，许多转录因子和辅助因子确实需要对组织进行光固定以获得最佳结果。一些低丰度和/或弱结合转录选项因子和辅助因子可能需要介质固定（0.1% 甲醛 10 分钟）以获得最佳结果。此外，在使用困难的组织类型（如纤维组织）时，介质固定可以改善结果。请注意，过度固定会抑制 CUT&RUN 检测。固定的组织样本在使用前可在 -80°C 下冷冻长达 6 个月。

注意：为 CUT&RUN 准备新鲜组织（未固定）时，我们建议在准备组织之前准备 Concanavalin A Beads（第 II 部分，步骤 1 至 5），以最大程度地减少细胞在准备过程中停留的时间。激活的珠子可以储存在冰上直到准备使用。

注意：以下试剂是固定组织制备所必需的并且不包含在该试剂盒中：37% 甲醛或 16% 甲醛无甲醇 #12606 、磷酸盐缓冲盐水 (PBS) #9872、甘氨酸溶液 (10X) #7005 和 10% SDS 溶液 #20533。

开始之前：

！所有缓冲卷都应该是 inc根据正在执行的 CUT&RUN 反应的数量按比例增加。

取出并加热 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 和 100X Spermidine #27287。确保两者都完全解冻。准备 1X 洗涤缓冲液（每种组织类型 3 ml，每个反应或输入样品额外 100 µl）。例如，要制备 3.5 ml 1X 洗涤缓冲液，添加 350 µl 10X Wash Buffer #31415 + 35 µl 100X Spermidine #27287 + 17.5 µl 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 + 3097.5 µl Nuclease-free Water #12931。将其平衡至室温以尽量减少对细胞的压力。如果需要组织固定，请准备以下缓冲液：通过添加 2.7 µl 37% 甲醛或 6.25 µl 16% 甲醛无甲醇，为每种组织类型准备 1 ml 固定缓冲液 # 12606 和 5 µl 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 加入 1 ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) #9872。使用未超过制造商 exp 的新鲜甲醛激活日期。为每种组织类型准备 1 ml PBS #9872 + 5 µl Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 并置于冰上。每 1 ml 固定缓冲液准备 100 µl 甘氨酸溶液 (10X) #7005。称量 1 mg 新鲜组织用于每个抗体/MNase 反应和额外的 1 mg 组织用于输入样本。确保包含阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 和阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 的反应。

注意：对于某些转录因子或辅助因子，或对于纤维组织等困难组织类型，每次反应最多可使用 5 mg 组织，而无需按比例增加试剂。

将组织样本放入培养皿中，并使用干净的手术刀或剃刀切碎刀刃。把菜放在冰上。保持组织低温以避免蛋白质降解很重要。

注意：我们建议对组织进行光固定，因为这种条件对大多数组织类型和蛋白质 ta 最有效目标。但是，如果需要新鲜组织，请跳过第 3 步到第 8 步并立即进行第 9 步。

立即将切碎的组织转移到 1 ml 固定液中并旋转管以混合。

注意：此体积的固定液足以处理高达 50 毫克的组织。如果处理 >50 mg，相应地在步骤 7 中放大固定溶液和 1X PBS + PIC 溶液。

在室温下孵育 2 分钟。

注意：对于困难的组织类型（如纤维组织）或低丰度和/或弱结合转录因子或辅助因子，将甲醛固定时间延长至 10 分钟可能会改善结果。

通过每 1 毫升固定缓冲液添加 100 微升甘氨酸溶液 (10X) #7005 来停止交联。旋转试管以混合并在室温下孵育 5 分钟。在 4°C 下以 2,000 x g 离心组织 5 分钟并去除液体。用 1 ml 1X PBS + PIC 重悬组织。以 2,000 x g 离心 5 分钟4°C 并去除液体并继续执行步骤 9。（SAFE STOP) 或者，固定的组织沉淀在解聚前可在 -80°C 下保存长达 6 个月。在 1 ml 的 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）中重悬组织，并将样品转移到 Dounce 匀浆器中。解聚组织块以 20-25 次冲程进入单细胞悬液，直到观察不到组织块。将细胞悬液转移到 1.5 ml 管中，并在室温下以 3,000 x g 离心 3 分钟，从细胞中去除上清液。将细胞沉淀重悬于 1 ml 1X洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）。在室温下以 3,000 x g 离心细胞悬液 3 分钟并去除液体。重复步骤 12 和 13 一次，再次洗涤细胞沉淀。对于每个反应，加入 100 µl 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）并通过轻轻上下移液来重悬细胞沉淀。将 100 µl 细胞转移到新试管中并在 4°C 下储存直至第 V 部分。这是输入样本。

注意：输入样品稍后将在 55°C 下孵育在协议中，因此建议使用安全锁 1.5 ml 试管以减少孵育过程中的蒸发。

立即进行第 II.II 部分。 Concanavalin A Beads 和一抗的结合开始前：

!所有缓冲液体积应根据进行的 CUT&RUN 反应的数量按比例增加。

将伴刀豆蛋白 A Bead Activation Buffer 置于冰上。对于每个反应，准备 1 µl 100X Spermidine #27287 + 0.5 µl 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 + 2.5 µl Digitonin Solution #16359 + 96 µl Antibody Binding Buffer #15338 并置于冰上（每次反应 100 µl）。轻轻上下移液，小心重悬 Concanavalin A Magnetic Beads，确保不要将任何磁珠悬浮液溅出管子。每次 CUT&RUN 反应将 10 µl 磁珠悬浮液转移到新的 1.5 ml 微量离心管中。

注意：避免涡旋混合 Concanavalin A Magnetic Bead 悬浮液，因为反复涡旋可能会分散将 Concanavalin A 从珠子中取出。

每 10 µl 珠子添加 100 µl Concanavalin A Bead Activation Buffer。通过上下移液器轻轻混合珠子。将试管放在磁性架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后取出液体。

注意：为避免珠子丢失，请使用移液管取出液体。不要使用真空抽吸。

从磁力架上取下试管。重复第 2 步和第 3 步，再次清洗珠子。添加体积等于添加的珠子悬浮液初始体积（每个样品 10 µl）的 Concanavalin A Bead Activation Buffer，并通过上下移液器重悬。

注意：如果按照活细胞和新鲜组织的建议，在细胞或组织制备之前准备好刀豆球蛋白 A 珠子，则可以将活化的珠子储存在冰上直至使用。

确保将刀豆球蛋白 A 珠子充分混合到溶液中。每次反应添加 10 µl 活化的珠悬浮液到第 I-A Ste 部分中制备的洗涤细胞悬浮液中第 8 页，第 I-B 部分第 10 步，或第 I-C 部分第 17 步。通过上下移液器将样品充分混合。在室温下孵育 5 分钟。

注意：伴刀豆球蛋白 A 磁珠可能会结块或粘在管壁上。珠子可以通过上下移液器重悬。

将样品以 100 x g 的速度短暂离心 2 秒，以从管盖中去除细胞：珠子悬浮液。将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后取出并丢弃液体。从支架上取下试管。每次反应添加 100 µl 抗体结合缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷）并置于冰上。将 100 µl 细胞：珠悬浮液等分到单独的 1.5 ml 管中用于每个反应并置于冰上。添加适量的抗体加入每个反应中，并通过上下移液器轻轻混合。

注意：CUT&RUN 所需的抗体量各不相同，应由用户确定。对于阳性对照三甲基组蛋白 H3 (Lys4)(C42D8) Rabbit mAb #9751，向样品中添加 2 µl 抗体。对于阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362，向样品中添加 5 µl。我们强烈建议使用阴性对照抗体而不是无抗体对照，因为后者会导致高水平的非特异性 MNase 消化和高背景信号。我们建议尽可能使用输入样本与 qPCR 和 NG-seq 分析进行比较。

在 4°C 下孵育试管 2 小时。此步骤可延长至过夜。

注意：伴刀豆球蛋白 A 磁珠可能会结块或粘附在管壁上。珠子可以通过上下移液器重悬。

III.开始前 pAG-MNase 酶的结合：

！所有缓冲液体积应根据正在执行的 CUT&RUN 反应的数量按比例增加。

取出 Digitonin Solution #16359 并将其加热至 90-100°C 5 分钟，确保其完全解冻并溶解。即时的立即将解冻的洋地黄皂苷溶液 #16359 置于冰上。

注意：洋地黄皂苷溶液 #16359 应储存在 -20°C 下。使用期间请置于冰上，当天结束后保存在 -20°C。

对于每个反应，准备 1.05 ml 洋地黄皂苷缓冲液（105 µl 10X Wash Buffer #31415 + 10.5 µl 100X Spermidine #27287 + 5.25 µl 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 + 26.25 µl Digitonin Solution #16359 + 903 µl Nuclease-free Water #12931）。对于每个反应，通过添加 50 µl 洋地黄皂苷缓冲液（如上所述）和 1.5微升 pAG-MNase 酶到新管中。例如，对于 10 次反应，将 500 µl 洋地黄皂苷缓冲液转移到新试管中并添加 15 µl pAG-MNase 酶。轻轻上下吹打混匀并置于冰上。将第 II 部分步骤 12 中的样品以 100 x g 离心 2 秒，以从管盖上去除细胞：珠子悬浮液。将管置于磁力架上直至溶液溶解n 变清（30 秒至 2 分钟），然后取出液体。从磁力架上取出试管，加入 1 ml 洋地黄皂苷缓冲液（+亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷）。通过轻轻上下吹打重悬珠子，确保收集到粘在管壁上的所有珠子。将管子放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后取出液体。取出管子从磁力架。向每个试管中加入 50 µl pAG-MNase 预混液，并通过上下移液器轻轻混合样品。在 4°C 下孵育试管 1 小时。

注意：刀豆球蛋白 A 磁珠可能会结块或粘在侧面管的。可以通过上下吹打来重新悬浮珠子。

立即进行第 IV.IV 节。 DNA 消化和扩散开始之前：

！所有缓冲液体积都应根据正在执行的 CUT&RUN 反应的数量按比例增加。

取出 Digitonin Solution #16359 并将其加热至 90-100°C 5 分钟，并确保它完全符合要求敬畏和解决方案。立即将解冻的洋地黄皂苷溶液 #16359 置于冰上。

注意：洋地黄皂苷溶液 #16359 应储存在 -20°C 下。使用期间请置于冰上，当天结束后保存在 -20°C。

对于每个反应，准备 2.15 ml 洋地黄皂苷缓冲液（215 µl 10X Wash Buffer #31415 + 21.5 µl 100X Spermidine #27287 + 10.75 µl 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 + 53.75 µl Digitonin Solution #16359 + 1.849 ml Nuclease-free Water #12931）。将氯化钙置于冰上。如果从第 I 部分中的固定材料开始，确保 10% SDS Solution #20533 完全溶解在溶液中。将其加热至 37°C 有助于溶解 SDS 沉淀物。对于每个反应，准备 150 µl 1X 终止缓冲液（37.5 µl 4X 终止缓冲液 #48105 + 3.75 µl Digitonin Solution #16359 + 0.75 µl RNAse A #7013 + 108 µl Nuclease-free Water #12931)。

可选：样品标准化 Spike-In DNA 可以添加到 1X Stop Buf 中fer 如果需要样本归一化（例如，参见第 VII 节中的图 8）。对于 qPCR 分析，我们建议在每个反应中添加 5 µl (5 ng) Spike-In DNA。对于 NG-seq 分析，我们建议将 Sample Normalization Spike-In DNA 稀释 100 倍到 Nuclease-free Water #12931 中，然后向每个反应中添加 5 µl (50 pg) Spike-In DNA。当每次反应使用 100,000 个细胞或 1 mg 组织时，这可确保标准化读数约为总测序读数的 0.5%。如果每个反应使用多于或少于 100,000 个细胞或 1 mg 组织，请按比例增加或减少样本标准化 Spike-In DNA 的体积，以将标准化读数调整为总读数的 0.5% 左右。

短暂离心样品来自第 III 部分，第 6 步，以 100 x g 离心 2 秒，以从管盖中去除细胞：珠悬浮液。将管放在磁力分离架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后去除液体.Remove 管 from 磁选架。加入 1 ml 洋地黄皂苷缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷）并轻轻上下移液以重悬珠子。重复步骤 2 和 3 一次。将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟） )，然后取出液体。从磁力架上取出试管。向每个试管中加入 150 µl 洋地黄皂苷缓冲液（+ 亚精胺 + PIC + 洋地黄皂苷）并通过上下吹打混合。消化前将试管置于冰上 5 分钟以冷却。通过向每个试管中加入 3 µl 冷氯化钙激活 pAG-MNase管并通过上下吹打混合。将样品在 4°C 下孵育 30 分钟。

注意：消化应在 4°C 冷却块或冰箱中进行。冰的温度可低至 0°C，这会限制消化并降低信号。

向每个样品添加 150 µl 1X 终止缓冲液（+ 洋地黄皂苷 + RNAse A + spike-in DNA [可选]）并通过移液器上下吹打混合。将试管在 37°C 无线孵育 10 分钟不要摇动以将 DNA 片段释放到溶液中。在 4°C 下以 16,000x g 离心 2 分钟，然后将试管放在磁力架上，直到溶液澄清（30 秒至 2 分钟）。将上清液转移到新的 2 ml 微量离心机中管。这些是您的富集染色质样本。

注意：如果活细胞或新鲜组织（未固定）用于 CUT&RUN 检测，请跳过第 14-15 步并立即进行第 16 步。

注意：固定样本稍后将在 65°C 下孵育，因此建议使用 safe-lock 2 ml 管以减少孵育期间的蒸发。

要逆转固定细胞或组织样本中的交联，允许将样品加热至室温，然后向每个样品中加入 3 µl 10% SDS Solution #20533（终浓度为 0.1%）和 2 µl 蛋白酶 K (20 mg/ml) #10012。

注意：SDS 可能会沉淀出来如果样品未预热至室温，则溶液的体积。

涡旋每个样品并在 65°C 下至少孵育吨 2 小时。这种孵育可以延长过夜。孵育后，以 10,000 x g 的速度快速旋转样品 1 秒，以收集管盖上的蒸发物。将样品平衡至室温，然后继续进行第 VI 部分。 （安全停止）或者，样品可以在 -20°C 下储存长达 1 周。但是，一定要在 DNA 纯化前将样品加热至室温（第 VI 部分）。 V. 输入样本的制备

输入 DNA 的片段化对于与下游 NG 测序的兼容性是必需的，但对于下游 qPCR 分析不是必需的。如果没有超声仪，我们建议使用未片段化的输入 DNA 进行 qPCR 分析；但是，输入 DNA 应使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化，因为未片段化的输入 DNA 太大而无法使用 DNA 离心柱进行纯化。如果没有超声仪并且需要进行下游 NG 测序分析，可以使用 CUT&RUN normal IgG antibody sample 作为阴性对照，尽管这并不理想，因为正常的富含 IgG 的样品可能显示非特异性 DNA 富集。或者，使用 MNase 的输入 DNA 片段化方案可在 https://cst-science.com/CUT-RUN-input-digestion 获得。

！所有缓冲液体积应根据准备的输入样本数量按比例增加。

开始前：取出并加热 DNA Extraction Buffer #42015。确保它完全解冻。对于每个输入样本，准备 2 µl Proteinase K #10012 + 0.5 µl RNAse A #7013 + 197.5 µl DNA Extraction Buffer #42015（每个输入样本总共 200 µl）。加入 200 µl DNA Extraction Buffer （+ 蛋白酶 K + 核糖核酸酶 A）添加到来自第 I-A 步第 7 步、第 I-B 步第 9 步或第 I-C 步第 16 步的 100 µl 输入样本中。通过上下吹打混合。将试管在 55°C 下摇动 1 小时。将试管置于冰上 5 分钟以完全冷却样品。裂解细胞并破碎色度通过对输入样品进行超声处理来锡。在两次脉冲之间将样品在冰上孵育 30 秒。

注意：超声处理条件可能需要根据附录 B 中的方案测试不同的超声功率设置和/或超声处理持续时间来凭经验确定。最佳超声处理条件将产生染色质片段大小范围为 100-600 bp。使用设置为 6 的 VirTis Virsonic 100 超声波匀浆器/超声仪和 1/8 英寸探针对 5 组 15 秒脉冲进行超声处理，充分破碎输入的染色质。

通过在 18,500 x g 下离心 10 分钟澄清裂解物4°C。将上清液转移到新的 2 ml 微量离心管中。立即进行第 VI 节 DNA 纯化。 （安全停止）或者，样品可以在 -20°C 下储存长达 1 周。但是，一定要在 DNA 纯化程序（第 VI 部分）之前将样品加热到室温。 DNA 纯化

可以从输入和富集的染色质样品中纯化 DNA使用 DNA 离心柱，如第 VI - A 部分所述，或苯酚/氯仿提取，然后如第 VI - B 部分所述的乙醇沉淀。使用 DNA 离心柱纯化简单快速，可很好地回收 35 bp 以上的 DNA 片段（图 7A，泳道 2）。苯酚/氯仿提取后进行乙醇沉淀更加困难，但可以更好地回收低于 35 bp 的 DNA 片段（图 7A，泳道 3）；然而，如图 7B 所示，CUT&RUN 分析中生成的大多数 DNA 片段都大于 35 bp。因此，DNA 离心柱提供了一种快速简单的方法来纯化 > 98% 的总 CUT&RUN DNA 片段。

纯化的 DNA 可以在 NG-seq 分析之前使用基于 picogreen 的 DNA 定量分析进行定量.对于包含 100,000 个细胞的 CUT&RUN 反应，对于转录因子和辅助因子，CUT&RUN 反应的预期 DNA 产量范围为每次反应 0.5 至 10 ng，以及 1 至 20每次组蛋白修饰反应 ng。

图 7. 使用离心柱或苯酚/氯仿提取后进行乙醇沉淀的 DNA 纯化比较。 (A) 使用 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209（泳道 2）或苯酚/氯仿提取然后乙醇沉淀（泳道 3）纯化低范围 DNA 梯形混合物（泳道 1，未纯化）并通过电泳分离在 4% 琼脂糖凝胶上。如图所示，苯酚/氯仿随后进行乙醇沉淀可有效回收所有大小的 DNA 片段，而 DNA 离心柱可回收 ≥ 35 bp 的 DNA 片段。(B) 使用苯酚/氯仿提取然后乙醇沉淀从使用 TCF4/TCF7L2 进行的 CUT&RUN 测定中纯化 DNA (C48H11) 兔单克隆抗体 #2569。使用 Bi 分析文库中 DNA 片段的大小分析仪（安捷伦科技）。在构建过程中添加到库中的适配器和条形码序列占片段长度的 140 bp。因此，起始 35 bp 的 DNA 片段在文库制备后长度为 175 bp（图中用蓝色垂直线表示）。如图所示，不到 2% 的 CUT&RUN 富集 DNA 片段总数小于 175 bp（起始长度为 35 bp），表明 DNA 纯化离心柱足以捕获超过 98% 的 CUT&RUN DNA 片段总数。

A.使用离心柱纯化 DNA

注意：可以使用 DNA 纯化缓冲液和离心柱（ChIP、CUT&RUN）#14209（未包含在该试剂盒中）和以下修改后的方案从输入和富集的染色质样品中纯化 DNA。修改步骤 1 至 5 以反映向 300 µl 输入和富集染色质样品中添加 5 体积（1.5 ml）DNA 结合缓冲液的要求。

开始之前：！！加入 24 毫升乙醇 (96-100%) 使用前加入 DNA Wash Buffer。此步骤只需在第一组 DNA 纯化之前执行一次。为每个富集染色质样品或要纯化的输入样品移除一个 DNA 纯化收集管。向每个输入和富集染色质样品添加 1.5 ml DNA 结合缓冲液并混合

注意：每 1 体积样品应使用 5 体积的 DNA 结合缓冲液。

将步骤 1 中的每个样品 600 µl 转移到收集管中的 DNA 离心柱中。离心在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。从收集管中取出离心柱并丢弃液体。更换空收集管中的离心柱。重复步骤 2-4，直到步骤 1 中的整个样品都通过离心柱旋转。更换空收集管中的离心柱。将 750 µl DNA 洗涤缓冲液添加到收集管中的离心柱。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。从离心机中取出离心柱e 收集管并丢弃液体。更换空收集管中的离心柱。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒。丢弃收集管和液体。保留离心柱。在每个离心柱中加入 50 µl DNA 洗脱缓冲液并放入干净的 1.5 ml 管中。在微量离心机中以 18,500 x g 离心 30 秒以洗脱 DNA。取出并丢弃 DNA 离心柱。洗脱液现在是纯化的 DNA。 （安全停止）样品可在 -20°C 下储存长达 6 个月。B.使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀纯化 DNA

注意：苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀需要以下试剂，但不包含在该试剂盒中：苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1) 、氯仿/异戊醇 (24:1)、3M 乙酸钠 (pH 5.2)、20mg/ml 糖原、100% 乙醇、70% 乙醇和 1X TE 缓冲液或无核酸酶水 #12931。

添加 300微升苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1) 到每个输入和富集的染色质样品，涡旋 30 秒彻底混合。在微量离心机中以 16,000 x g 离心 5 分钟分离层。小心地将顶部水层的大部分（避开中间相）转移到新管中。将 300 µl 氯仿/异戊醇 (24:1) 添加到水样中，涡旋 30 秒彻底混合。在 16,000 离心分离各层x g 在微量离心机中 5 分钟。小心地将大部分顶部水层（避开中间相）转移到新管中。向每个水样中加入 25 µl 3M 醋酸钠 (pH 5.2)、1 µl 20mg/ml 糖原和 600 µl 100% 乙醇并混匀涡旋振荡 30 秒。在 -80°C 下孵育样品 1 小时或 -20°C 过夜以沉淀 DNA。在微量离心机中 4°C 下以 16,000 x g 离心 5 分钟沉淀 DNA。小心去除上清液并洗涤沉淀含 70% 乙醇。在 4°C 下于微分中以 16,000 x g 离心 5 分钟沉淀 DNArifuge。倒出上清液并风干沉淀。在 50 µl 1X TE 缓冲液或 Nuclease-free Water #12931 中重悬沉淀。这是纯化的 DNA。 （安全停止）样品可在 -20°C 下储存长达 6 个月。VII。通过 qPCR 对 DNA 进行定量建议：试剂盒中包含的样品标准化引物组特定于酿酒酵母 ACT1 基因，可用于量化来自样品标准化掺入酵母 DNA 的信号以进行样品标准化（可选）。包括额外的对照引物试剂盒中的特异性针对人或小鼠 RPL30 基因（#7014 或#7015），可用于三甲基组蛋白 H3 (Lys4)(C42D8)Rabbit mAb #9751 样品的实时定量 PCR 分析。如果用户对另一个物种进行 CUT&RUN，则用户需要设计合适的对照引物并确定该物种的最佳 PCR 条件。PCR 引物的选择至关重要。对于 CUT&RUN，PCR 扩增子大小应约为 60 至 80 bpinlength。引物的最佳熔解温度应设计在 60°C 左右，GC 含量约为 50%。2 µl 纯化的 DNA 足以对组蛋白、转录因子和辅助因子的靶基因进行 qPCR 介导的定量。A 热启动 Taq建议使用聚合酶，以最大限度地降低非特异性 PCR 产物的风险。使用带过滤头的移液器吸头，以最大限度地降低污染风险。标记与要使用的 PCR 机器型号兼容的适当数量的 PCR 管或 PCR 板。 PCR 反应应包括阳性对照三甲基组蛋白 H3 Lys4 样品、阴性对照兔 IgG 样品、不含 DNA 的试管以控制 DNA 污染，以及连续稀释的输入 DNA（未稀释、1:5、1:25、 1:125) 创建标准曲线并确定扩增效率并量化每个免疫富集样本中的 DNA 量。

注意：如果执行样本归一化，则仅使用 SampleNor 分析 CUT&RUN 样本化引物集。输入 DNA 不包含归一化掺入 DNA。

将 2 µl 适当的 DNA 样本添加到 PCR 板的每个试管或孔中。如下所述制备主反应混合物。为每个 PCR 反应设置 2-3 个重复。添加足够的试剂以弥补体积损失（1-2 次额外反应）。向每个 PCR 反应管或孔中加入 18 µl 反应混合物。1 个 PCR 反应的试剂体积 (18 µl)Nuclease-free H2O #129316 µl5 µM Primers2 µlSimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #8898910 µl 启动以下 PCR 反应程序：a.Initial Denaturation95 °C 3 分钟。变性 95°C 15 秒。退火和延伸 60°C 60 秒。重复步骤 b 和 c 共 40 个循环。使用实时 PCR 机器提供的软件分析定量 PCR 结果。或者，可以使用百分比输入法和下面显示的等式手动计算 IP 效率。使用这种方法，s从每个免疫沉淀中获得的信号表示为总输入染色质的百分比。输入百分比 = 100% x 2（C[T] 100% 输入样本 - C[T] IP 样本）C[T] = CT = PCR 的平均阈值循环反应对于样本归一化，选择样本归一化引物组的 C[T] 值最低的样本作为所选样本（例如下表示例中的样本 1），并使用以下等式计算其他样本的归一化因子。使用各自的归一化因子调整来自测试引物组的信号。qPCR 检测样本归一化示例（参见图 8）样本归一化引物集的 C[T] 值**归一化前 qPCR 信号的归一化因子（% 输入计算来自步骤 5)标准化后的信号样本 123.312(23.31-23.31)=1.0024.4%24.4%/1.00=24.4%样本 224.242(23.31-24.24)=0.5212.0%12.0%/0.52=23.1%样本 325.082 (23.31-25.08 )=0.296.28%6.28%/0.29=21.7%样本426.302(23.31-26.30)=0.132.72%2.72%/0.13=20.9%

**qPCR 的归一化因子 = 2（C[T] 选定样本 - C[T] 其他样本）

图 8. 使用 DNA 中的尖峰对 CUT&RUN 信号进行标准化以进行 qPCR 分析。使用数量减少的 HCT116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8)Rabbit mAb#9751（上图）或 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499（下图）进行 CUT&RUN .使用 SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516、SimpleChIP® Human β-ActinPromoter Primers #13653、SimpleChIP® Human β-Actin 3\' UTR Primers #13669 和 SimpleChIP® HumanMyoD1 Exon 1 Primers # 通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量4490。每个样本中免疫沉淀的 DNA 量表示为相对于 100,000 个细胞的输入染色质总量的信号。左图描述了非标准化富集面板。样品归一化 Spike-In DNA 按起始细胞数的比例添加到每个反应中。基于每个样品中 DNA 刺突的 qPCR 信号的差异，CUT&RUN 信号被归一化为包含 100,000 个细胞的样品。归一化富集如右图所示。

VIII. NG-Sequencing Library Construction

使用该试剂盒制备的免疫富集 DNA 样本可直接与 NG-seq 兼容。对于下游 NG-seq DNA 文库构建，请使用与您的下游测序平台兼容的 DNA 文库制备方案或试剂盒。对于 Illumina® 平台上的测序，我们建议使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 和 Multiplex Oligos for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 #47538，遵循 CUT&RUN 协议DNA。

由于 CUT&RUN 中产生的背景信号非常低，每个样本 500 万个读数的测序深度通常足够 f或组蛋白修饰和转录因子。如果每个样本的测序深度大于一千五百万，则读数的重复率会显着增加。如果每个样本的测序深度低于 200 万，则信噪比会降低。对于少于 20,000 个起始细胞数，通常会在 NGS 读数中获得较低的映射率或较高的重复率。如果发生这种情况，我们建议增加测序深度以获得足够数量的独特映射读数用于下游数据分析。在执行样本归一化时，将所有样本的 CUT&RUN 测序数据映射到测试参考基因组（例如人类）和样本归一化酿酒酵母基因组。选择具有最少独特酵母读数的样本作为所选样本（例如下表中的样本 1），并使用以下等式计算其他样本的归一化因子。减少与测试引用对齐的唯一读取的数量使用各自的归一化因子对每个样本进行基因组分析。使用缩小的数据集进行进一步的 NGS 分析。NGS 分析的样本标准化示例与酵母对齐的唯一读取数 NGS 的标准化因子标准化前与测试参考基因组对齐的唯一读取数标准化后与测试参考基因组对齐的唯一读取数样本 1219 ,275219,275/219,275 = 1.005,077,7475,077,747 X 1.00 = 5,077,747样本 2411,915219,275/411,915 = 0.539,896,6719,896,671 X 0.53 = 5, 268,306样本 3816,235219,275/816,235 = 0.2717,842 ,77317,842,773 X 0.27 = 4,793,320样本 41,120,826219,275/1,120,826 = 0.2023,836,67923,836,679 X 0.20 = 4,663,339

NGS 的归一化因子 = 独特的数量酵母从选定样本中读取/独特的数量酵母从其他样品中读取

附录 A：细胞对洋地黄皂苷的敏感性的测定

在 CUT&RUN 方案中，向缓冲液中添加洋地黄皂苷有助于细胞膜透化以及一抗和 pAG-MNase 酶进入细胞和细胞核。因此，在缓冲液中加入足量的洋地黄皂苷对于抗体和酶的成功结合以及目标基因组位点的消化至关重要。不同的细胞系对毛地黄皂苷细胞透化作用表现出不同的敏感性。虽然本协议中推荐的洋地黄皂苷的量应足以透化大多数细胞系或组织，但您可以使用此协议测试特定的细胞系或组织。我们发现添加过量的毛地黄皂苷对测定无害，因此无需绘制浓度曲线。相反，快速测试以确定推荐量的毛地黄皂苷是否适合您的细胞系。

开始前：取出毛地黄皂苷溶液 #16359 并将其加热至 90-100°C 5 分钟。确保它完全解冻。立即将解冻的 Digitonin Solution #16359 放在我的ce.

注意：Digitonin Solution #16359 应储存在 -20°C 下。请在使用过程中保持在冰上，并在一天结束后储存在 -20°C。

对于每个细胞或组织样品，准备 100 µl 洗涤缓冲液（10 µl 10X 洗涤缓冲液 #31415 + 90 µl 无核酸酶水 #12931)。此测试无需添加亚精胺或蛋白酶抑制剂。在 1.5 ml 管中，收集 10,000 - 100,000 个细胞。对于组织，从 1 mg 组织中收集分解细胞（第 I-C 部分步骤 1-13）。如果您在 CUT&RUN 实验中使用固定的细胞或组织，请确保以与此测试相同的方式固定细胞或组织。在室温下以 600 x g 离心 3 分钟并吸出液体。

注意：如果肉眼看不到细胞沉淀，我们建议在步骤 2 中初始离心细胞悬液后尽可能多地去除细胞培养基而不干扰细胞沉淀，并在每次反应中留下一些细胞培养基。然后在步骤 3 中添加足够的 1X向细胞悬浮液中加入洗涤缓冲液，使总体积达到 100 µl。

在 100 µl 洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀。向每个反应中添加 2.5 µl Digitonin Solution #16359，并在室温下孵育 10 分钟。混合 10微升细胞悬浮液，含 10 微升 0.4% 台盼蓝染色剂。使用血细胞计数器或细胞计数器计算染色细胞数和细胞总数。充分透化会导致 > 90% 的细胞被台盼蓝染色。如果台盼蓝染色的细胞少于 90%，则增加添加到洋地黄皂苷缓冲液中的 Digitonin Solution #16359 的量，并重复步骤 1-5 直到 > 90%细胞被透化和染色。在第 I - IV 部分中使用此量的 Digitonin Solution #16359。附录 B：输入样本的超声处理优化

建议对输入 DNA 样本进行超声处理，因为使用 DNA 纯化只能纯化片段化的基因组 DNA (<10 kb)自旋柱。此外，吨片段化的基因组 DNA (<1kb) 可用作 NG-seq 分析中的阴性对照。应优化超声处理，使输入 DNA 的长度为 100-600 bp。

我们建议将输入样本用于 NG-seq，因为它提供了细胞基因组的方便和公正的表示。虽然 IgG 样本也可用作 NG-seq 的阴性对照，但由于非特异性结合，它可能会显示基因组特定区域的富集。未片段化的输入 DNA 可用于 qPCR 分析。然而，未片段化的 DNA 必须使用苯酚/氯仿提取然后乙醇沉淀进行纯化。

开始之前：

！所有缓冲液体积应根据准备的输入样本数量按比例增加。

取出 DNA Extraction Buffer #42015 并在室温下加热，确保其完全解冻并溶解。对于每个输入样本，准备 2.1 ml 1X 洗涤缓冲液（210 µl 10X 洗涤缓冲液 #31415 + 1.89 ml 无核酸酶水#12931) 并将其平衡至室温以最大程度地减少对细胞的压力。无需向该洗涤缓冲液中添加亚精胺或蛋白酶抑制剂混合物 #7012。对于每个输入样品，准备 2 µl Proteinase K #10012 + 0.5 µl RNAse A #7013 至 197.5 µl DNA Extraction Buffer #42015（每次输入 200 µl样本）。在 1.5 ml 试管中，针对每个测试的超声处理条件，收集与您在 CUT&RUN 实验中用于输入的相同数量的细胞（5,000 至 100,000 个细胞）。对于组织，从您在 CUT&RUN 实验（第 I-C 部分步骤 1-13）中输入的相同数量的组织中收集分解的细胞，用于测试的每个超声处理条件。如果您在实验中使用固定的细胞或组织，请确保以与此测试相同的方式固定细胞或组织。在室温下以 600 x g 离心 3 分钟并去除液体。

注意：如果离心使用低细胞数时肉眼看不到细胞沉淀s（<100,000 个细胞），我们建议跳过下面的洗涤步骤 3-5。在步骤 2 中初始离心细胞悬浮液后，在不干扰细胞沉淀的情况下尽可能多地去除细胞培养基，并在每次反应中留下一些细胞培养基。然后在步骤 6 中，向细胞悬浮液中添加足够的 1X 洗涤缓冲液，以达到每个待测超声处理条件 100 µl 的体积。

通过轻轻上下吹打，将细胞沉淀重悬于 1 ml 1X 洗涤缓冲液中。离心 3在室温下以 600 x g 的速度分钟并去除液体。通过重复步骤 3 和 4 一次来再次清洗细胞沉淀物。在每个待测试的超声处理条件下添加 100 µl 1X 洗涤缓冲液，并通过轻轻上下吹打来重悬细胞沉淀物。针对每种超声处理条件，将 100 µl 细胞悬液等分到新试管中。

注意：在第 9 步中，样品将在 55°C 下孵育，因此建议使用安全锁 1.5 ml 试管以减少过程中的蒸发孵化。

向每个样品中加入 200 µl DNA 提取缓冲液（+ 蛋白酶 K + 核糖核酸酶 A）并通过上下吹打混合。将试管置于 55°C 并摇动 1 小时。将试管置于冰上 5 分钟以完全冷却通过设置时间进程实验，增加 15 秒脉冲超声处理周期的数量，确定超声仪的最佳超声处理条件。一定要在两次脉冲之间将样品在冰上孵育 30 秒。通过在 4°C 下在微量离心机中以 18,500 x g 离心 10 分钟来澄清裂解物。将上清液转移到新的 2 ml 微量离心管中。按照第 VI 节中的说明，使用 DNA 纯化离心柱或苯酚/氯仿提取然后乙醇沉淀纯化 DNA 样品。从柱子中洗脱 DNA 或将 DNA 沉淀重悬于 30 µl 1X TE 缓冲液或无核酸酶水 #12931。通过电泳确定 DNA 片段大小。在带有 100 bp DNA 标记的 1% 琼脂糖凝胶上加载 > 15 µl 样品河建议使用无染料上样缓冲液（30% 甘油）以更好地观察凝胶上的 DNA 涂片。选择可产生 100-600 bp 最佳 DNA 片段大小的超声处理条件，并用于第 V 节中输入样品的制备，第 4 步。如果未达到最佳超声条件，请增加或减少超声仪的功率设置或超声循环次数，然后重复超声时程实验。附录 C：故障排除指南

有关详细的故障排除指南，请访问https://cst-science.com/troubleshooting-CUT-RUN

方案 ID：1884

特异性/灵敏度Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) 兔只有当羧基末端结构域 (CTD) 七肽重复序列 [Tyr1、Ser2、Pro3、Thr4、Ser5、Pro6、Ser7] 在 Ser2 处被磷酸化时，mAb 才能识别 Rpb1 的内源水平。该抗体不会与 Ser5 或 Ser7 磷酸化的 Rpb1 CTD 发生交叉反应。物种反应性：

人类、小鼠e, Rat, Monkey

根据 100% 序列同源性预测反应的物种：用于产生该抗体的抗原序列与此处列出的物种具有 100% 序列同源性，但反应性尚未经过 CST 测试或证实有效。将本产品用于这些物种不在我们的抗体性能保证范围内。

仓鼠、黑腹果蝇、非洲爪蟾、斑马鱼、牛、猪、酿酒酵母、 C. elegans

来源/纯化

使用与人 Rpb1 CTD 七肽重复的 Ser2 周围残基相对应的合成磷酸肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

RNA 聚合酶 II（RNAPII ) 是一种大型多蛋白复合物，作为 DNA 依赖性 RNA 聚合酶发挥作用，使用四种核糖核苷三磷酸作为底物催化 DNA 转录为 RNA (1)。最大的亚基，RNAPII 亚基 B1 (Rpb1)，也称为 RNAPII 亚基 A (POLR2A)，包含一个 u独特的七肽序列（Tyr1、Ser2、Pro3、Thr4、Ser5、Pro6、Ser7），在蛋白质的羧基末端结构域 (CTD) 中重复多达 52 次 (1)。这种 CTD 七肽重复序列受到多种翻译后修饰的影响，这决定了聚合酶复合物的功能状态。在活跃的转录周期中，CTD 的磷酸化通过调节染色质修饰酶和 RNA 加工蛋白向转录基因的募集，将转录与染色质重塑和新生 RNA 加工相结合 (1)。在转录起始期间，RNAPII 包含一个低磷酸化的 CTD，并通过与 DNA 结合的转录因子和介体复合物的相互作用被募集到基因启动子 (1)。 RNAPII 从基因启动子中逃逸需要 CDK7 对 Ser5 进行磷酸化，CDK7 是转录因子 IIH (TFIIH) 的催化亚基 (2)。 Ser5 的磷酸化介导 RNA 加帽酶的募集，以及 hist一种 H3 Lys4 甲基转移酶，其功能是调节转录起始和染色质结构 (3,4)。启动子逃逸后，RNAPII 将基因向下延伸到一个内在暂停位点，在那里它被负延伸因子 NELF 和 DSIF 终止 (5)。此时，RNAPII 不稳定并经常中止转录并与基因分离。有效的转录延伸需要 CDK9 在 Ser2 处磷酸化，CDK9 是正转录延伸因子 P-TEFb 的催化亚基 (6)。 Ser2 的磷酸化会产生稳定的转录延伸复合物，并促进 RNA 剪接和聚腺苷酸化因子的募集，此外还有组蛋白 H3 Lys36 甲基转移酶，其功能是促进与延伸相容的染色质 (7,8)。 Ser2/Ser5 磷酸化的 RNAPII 然后将基因的整个长度转录到 3\' 端，转录在此终止。 RNAPII 从 DNA 上解离并被回收到低磷酸化的m 由各种 CTD 磷酸酶 (1)。除了 Ser2/Ser5 磷酸化外，CTD 七肽重复序列的 Ser7 在活跃的转录周期中也被磷酸化。小核 (sn) RNA 基因的有效转录需要 Ser7 磷酸化 (9,10)。 snRNA 基因既没有剪接也没有聚腺苷酸化，在结构上与蛋白质编码基因不同。与在蛋白质编码 RNA 中发现的 poly(A) 信号不同，snRNA 包含一个保守的 3\'-box RNA 加工元件，该元件可被 Integrator snRNA 3\' 末端加工复合体识别 (11,12)。转录早期阶段 CDK7 对 Ser7 的磷酸化促进了 RPAP2 的募集，RPAP2 使 Ser5 去磷酸化，产生了一个双重 Ser2/Ser7 磷酸化标记，促进了整合子复合体的募集和新生 snRNA 转录本的高效处理 (13-15)。Brookes, E. 和 Pombo, A. (2009) EMBO Rep 10, 1213-9.Komarnitsky, P. 等。 (2000) Genes Dev 14, 2452-60.Ho,C.K.和 Shuman, S. (1999) Mol Cell 3, 405-11.Ng, H.H. 等。 (2003) Mol Cell 11, 709-19.Cheng, B. and Price, D.H. (2007) J Biol Chem 282, 21901-12.Marshall, N.F.等。 (1996) J Biol Chem 271, 27176-83.Krogan, N.J. 等。 (2003) Mol Cell Biol 23, 4207-18.Proudfoot, N.J. 等人。 (2002) Cell 108, 501-12.Chapman, R.D. 等人。 (2007) Science 318, 1780-2.Egloff, S. 等人。 (2007) Science 318, 1777-9.Egloff, S. 等人。 (2008) Biochem Soc Trans 36, 590-4.Baillat, D. 等人。 (2005) Cell 123, 265-76.Akhtar, M.S.等。 (2009) Mol Cell 34, 387-93.Egloff, S. 等人。 (2010) J Biol Chem 285, 20564-9.Egloff, S. 等人。 (2012) Mol Cell 45, 111-22.Pathways

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