class=\"container-fluid\">Supporting DataRelated ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsOn Page MenuProductsPrimary AntibodiesPhospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAbRecombinant：卓越的批次间一致性、连续供应和无动物制造。\">RRecombinant ×什么是重组抗体，为什么它很重要？

与传统抗体相比，重组抗体具有几个关键优势。这些优势包括批次间一致性、连续供应和无动物生产。因此，重组抗体越来越多地用于科学研究，特别是作为解决持续的可重复性危机的一种手段。

什么是重组抗体？

传统的多克隆抗体和单克隆抗体是正常B细胞​​发育和基因重组的产物离子。它们是通过用抗原对动物进行免疫以引发免疫反应而产生的。多克隆抗体由许多不同的 B 细胞克隆分泌并识别多个抗原表位，而单克隆抗体源自单个 B 细胞克隆并且仅针对一个表位。

重组抗体是单克隆抗体，但它们的产生涉及体外遗传操作。将抗体基因克隆到表达载体中后，将其转染到合适的宿主细胞系中进行抗体表达。哺乳动物细胞系最常用于重组抗体生产，尽管细菌、酵母或昆虫来源的细胞系也适用。

出色的批次间一致性

因为重组抗体生产涉及对抗体光进行测序和重型链条，这是一个高度可控且可靠的过程。相比之下，用于生产单克隆抗体的基于杂交瘤的系统容易发生遗传漂移和安装能力，增加批次间差异或抗体表达损失的可能性。重组抗体在批次之间高度一致，从而确保可重复的实验结果。

可扩展性

用于生产抗体的体外方法适合大规模生产，这意味着抗体可用性不太可能成为限制因素。此外，由于重组抗体序列已知，供应的连续性得到保证；在抗体将用于支持大型、长期研究的情况下，这可能是一个特别关键的因素。

无动物制造

与抗体生产的传统方法不同，重组方法无需使用动物。当多克隆抗体直接从免疫宿主的血清中纯化，单克隆抗体从杂交瘤来源的组织培养上清液或腹水中纯化时，重组抗体则从免疫宿主的组织培养上清液中纯化。转染的宿主细胞系。无论抗体是多克隆抗体、单克隆抗体还是重组抗体，在实验使用之前，都必须始终在预期应用中对其进行适当验证。在 CST，我们遵守 Hallmarks of Antibody Validation™，这是确定抗体在任何给定测定中的特异性、灵敏度和功能的六种互补策略。通过针对每种抗体产品仔细定制这些策略，我们保证 CST 抗体将按预期发挥作用，帮助您获得值得信赖的结果。

Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb#4060Reviews ()引用 (10779)Filter:WBIPIHCIFF对未经处理或 LY294002/渥曼青霉素处理的 PC-3 细胞和血清饥饿或 PDGF 处理的 NIH/3T3 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析，使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb（上）或 Akt（pan）(C67E7) Rabbit mAb #4691（下）。显示更少显示更多 Simple Western™ 分析使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060 从经 Calyculin A（100 uM，30 分钟）处理的 Jurkat 细胞中提取裂解物 (0.1 mg/mL)。虚拟泳道视图（左）显示了单一目标条带（如图所示），一抗稀释度为 1:10 和 1:50。相应的电泳图视图（右）绘制了沿毛细管以 1:10（蓝线）和 1:50（绿线）稀释一抗时分子量的化学发光。该实验是在还原条件下使用 12-230 kDa 分离模块在 BioTechne 品牌 ProteinSimple 的 Jess™ Simple Western 仪器上进行的。显示更少显示更多 磷酸 Akt 的免疫沉淀 ( Ser473) 来自经 Calyculin A #9902（100nM，30 分钟）处理的 Jurkat 提取物。泳道 1 是 10% 输入，泳道 2 是 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb，泳道 3 是兔 (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900。使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb 进行蛋白质印迹分析。Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074 用作二抗。显示更少显示更多使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb（左）或 PTEN (138G6) Rabbit mAb #9559 (右）。注意 P-Akt stai 的存在宁在 PTEN 缺陷的 MDA-MB-468 细胞中。显示更少显示更多P_283_20210423082458.jpg\" alt=\"Immunohistochemistry Image 2: Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb\">比较 SignalStain® Antibody Diluent #8112（左）与 TBST/5% 对石蜡包埋的人乳腺癌的免疫组织化学分析使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060 的正常山羊血清（右）。显示更少显示更多 使用 Phospho-Akt 对石蜡包埋的人乳腺癌进行免疫组织化学分析(Ser473) (D9E) XP® 兔单克隆抗体。显示更少显示更多 使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb on SignalSlide® Phospho-Akt (Ser473) IHC Controls #8101（石蜡）进行免疫组织化学分析-嵌入的 LNCaP 细胞，未经处理（左）或经 LY294002 处理（右）。显示更少显示更多 使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) 对石蜡包埋的人肺癌进行免疫组织化学分析) XP® 兔单克隆抗体。显示更少显示更多\"免疫组织化学图像 6：Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb\">使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的 PTEN 杂合突变小鼠子宫内膜进行免疫组织化学分析。（组织切片由马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布莱根妇女医院的 Sabina Signoretti 博士友情提供。）显示更少显示更多 LY294002 处理的 C2C12 细胞的共聚焦免疫荧光分析（左图） ) 或胰岛素处理（右），使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb（绿色）。肌动蛋白丝已用 Alexa Fluor® 555 phalloidin #8953（红色）标记。蓝色伪彩 = DRAQ5®#4084（荧光escent DNA 染料）。显示更少显示更多图片 1: Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb\">对未经处理（绿色）或经 LY294002 #9901、Wortmannin #9951 和 U0126 #9903（50 μM、1 μM）处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞术分析和 10 μM，2 小时；蓝色）使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb（实线）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（虚线）。 Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 用作二抗。显示更少显示更多图片库详细了解我们如何获取图像 × Phospho-Akt ( Ser473) (D9E) XP® 兔单克隆抗体 4060 在暗模式和亮模式之间切换过滤器：WBIPIHCIFF 使用 Phospho- Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb（上图）或 Akt（pan）(C67E7) Rabbit mAb #4691（下图）。Simple Western™ 裂解物分析 (0.1 mg/mL)来自使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060 使用 Calyculin A（100 uM，30 分钟）处理的 Jurkat 细胞。虚拟泳道视图（左）显示单个目标条带（如图所示）位于 1：一抗的 10 和 1:50 稀释度。相应的电泳图视图（右）绘制了沿毛细管以 1:10（蓝线）和 1:50（绿线）稀释一抗的分子量的化学发光。该实验进行了在还原条件下在 BioTechne 品牌 ProteinSimple 的 Jess™ Simple Western 仪器上，使用 12-230 kDa 分离模块。 对经 Calyculin A #9902（100nM，30 分钟）处理的 Jurkat 提取物中的磷酸化 Akt (Ser473) 进行免疫沉淀。泳道 1 是 10% 输入，泳道 2 是 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb，泳道 3 是 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900。使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb 进行蛋白质印迹分析。 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074 用作二抗。 石蜡包埋的 MDA-MB-468 xenogr 的免疫组织化学分析之后使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb（左）或 PTEN (138G6) Rabbit mAb #9559（右）。注意在 PTEN 缺陷型 MDA-MB-468 细胞中存在 P-Akt 染色。 使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit 对石蜡包埋的人乳腺癌进行免疫组织化学分析，比较 SignalStain® Antibody Diluent #8112（左）和 TBST/5% 正常山羊血清（右）单克隆抗体 #4060。 使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人乳腺癌进行免疫组织化学分析。 使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb 在SignalSlide® Phospho-Akt (Ser473) IHC Controls #8101（石蜡包埋的 LNCaP 细胞，未经处理（左）或经 LY294002 处理（右））。使用 Phospho 对石蜡包埋的人肺癌进行免疫组织化学分析-Akt (Ser473) (D9E) XP® 兔单克隆抗体。使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® R 对石蜡包埋的 PTEN 杂合突变小鼠子宫内膜进行免疫组织化学分析兔单克隆抗体。 （组织切片由马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布莱根妇女医院的 Sabina Signoretti 博士提供。）石蜡包埋的 U-87MG 异种移植物的免疫组织化学分析，未处理（左）或 λ 磷酸酶-使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb 处理（右）。 使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb（绿色）对 LY294002 处理（左）或胰岛素处理（右）的 C2C12 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白丝已用 Alexa Fluor® 555 phalloidin #8953（红色）标记。蓝色伪彩 = DRAQ5®#4084（荧光 DNA 染料）. 使用 Phospho 对未经处理（绿色）或经 LY294002 #9901、Wortmannin #9951 和 U0126 #9903（50 μM、1 μM 和 10 μM，2 小时；蓝色）处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞分析-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb（实线）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（虚线）。抗兔 IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 用作二抗。购买 #4060Cat。 #SizeQty.Price4060T20µl$1634060S100µl$4074060L300µl$958

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抗体保证FAQTech Support-- Datasheet --Without ImagesWith ImagesSDS: Choose Your RegionAmerica - 英语欧洲 - 中文欧洲 - 荷兰语欧洲 - 英语欧洲 - 法语欧洲 - 德语欧洲 - 意大利语欧洲 - 韩国欧洲 - 葡萄牙语欧洲 - 西班牙语欧洲 - 瑞典分析证书相关产品产品使用方案背景途径引文和评论支持数据反应性H M R Hm Mk Dm Z BSENSITIVITY内源性MW（kDa）60源/同种型兔IgG应用程序密钥：WB-Western B lotIP-免疫沉淀IHC -免疫组织化学 ChIP-染色质免疫沉淀 C&R-CUT&RUNC&T-CUT&TagDB-Dot BloteCLIP-eCLIPIF-免疫荧光F-流式细胞术物种交叉反应性键：H-人M-小鼠R-大鼠Hm-仓鼠Mk-猴病毒-病毒Mi-水貂C-鸡Dm-D. melanogasterX-X enopusZ-斑马鱼B- BovineDg-DogPg-PigSc-S. cerevisiaeCe-C. elegansHr-HorseGP-Guinea PigRab-RabbitAll-All Species Expected相关产品偶联物

产品信息

产品使用信息应用稀释Western Blotting1:2000Simple Western™1:10 - 1:50免疫沉淀1:50免疫组织化学（石蜡）1:50 - 1:200免疫荧光（免疫细胞化学）1:400 - 1: 800 流式细胞术（固定/透化）1:100 - 1:400存储

以 10 mM HEPES 钠 (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和少于 0.02% 的叠氮化钠提供。储存于 –20°C。不要等分抗体。

有关该产品的无载体（不含 BSA 和叠氮化物）版本，请参阅产品 #31957。

方案选择您的方案Western BlottingImmunoprecipitationImmunohistochemistry（石蜡)免疫荧光（免疫细胞化学）流式细胞术（固定/透化）PRINT

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Western Blotting Protocol

对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗以 5% w/v 孵育BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 在 4°C 下轻轻摇动，过夜。

注意：请参考一抗产品网页推荐的抗体稀释度页面。

A.溶液和试剂

从样品制备到检测，Western Blot 所需的试剂现在都在一个方便的试剂盒中：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：用反渗透去离子（ ... (#12498) 要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH2O，混合。1X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包 (#7722) 或红色上样包 (#7723) 通过添加准备新鲜的 3X 还原上样缓冲液1/10 体积的 30X DTT 到 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH2O 中，混合。10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：(#12539)要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加到 200 ml 甲醇中l + 700 ml dH2O，混合。10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST：将 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH2O，混合。脱脂奶粉：(#9999 ). 封闭缓冲液：1X TBST，含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加到 150 ml 1X TBST 中并充分混合。洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。一抗稀释缓冲液：1X TBST 与 5 ％牛血清白蛋白；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。生物素化蛋白 Ladder 检测包：(#7727)。蓝色预染蛋白标记物，宽范围 (11-250 kDa)：(#59329)。印迹膜和纸：(#12369) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议孔径为 0.2 µm。与 HRP 偶联的二抗：抗兔 IgG，HRP 连接抗体 (#7074)。检测试剂：SignalFire™ ECL 试剂 (#6883)。B. Protein BlottingA general protocol for sample preparation.通过在所需时间添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞。Aspira来自文化的媒体；用 1X PBS 清洗细胞；吸出。通过添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径板每孔 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移到微量离心管中。置于冰上。超声处理 10-15 秒以完成细胞裂解和剪切 DNA（以降低样品粘度）。将 20 µl 样品加热至 95-100°C 5 分钟；在冰上冷却。微量离心 5 分钟。

将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶（10 厘米 x 10 厘米）上。

注意：上样预染分子量标记（#59329，10 µl/ lane) 来验证电转移和生物素化蛋白质阶梯 (#7727, 10 µl/lane) 以确定分子量。

电转移到硝酸纤维素膜 (#12369).C.膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，相应地调整体积。

I.膜封闭（可选）转移后，清洗硝基细胞用 25 ml TBS 在室温下孵育 5 分钟。将膜在 25 ml 封闭缓冲液中在室温下孵育 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。II。一抗孵育在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育膜和一抗（按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂），在 4°C 下轻轻搅拌过夜。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。将膜与 Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody（#7074，1:2000）和抗生物素、HRP-linked Antibody（#7075，1:1000–1:3000）一起孵育，以检测 10 ml 中的生物素化蛋白质标记物在室温下轻轻搅拌封闭缓冲液 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。继续检测（D 部分）。蛋白质检测使用说明：在 TBST 中将膜结合的 HRP（抗体偶联物）洗涤 3 次，每次 5 分钟。通过将一份 2X 稀释来制备 1X SignalFire™ ECL 试剂 (#6883)试剂 A 和一份 2X 试剂 B（例如，对于 10 ml，添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B）。充分混合。将底物与膜一起孵育 1 分钟，去除多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露在 X 射线胶片上。

* 避免反复接触皮肤。

2005 年 6 月发布

2020 年 6 月修订

方案 ID：10

天然蛋白质的免疫沉淀

本方案是旨在利用蛋白 A 琼脂糖珠对天然蛋白进行免疫沉淀，以通过蛋白质免疫印迹或激酶活性进行分析。

A.溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 的 1X PBS，添加 50 ml 20X PBS 加入 950 ml dH2O，混合。

10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液加入 9 ml dH2O，混合。

注意：在使用前立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

3X SDS 样品缓冲液：蓝色上样包 (#7722) 或红色上样包 (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液中来制备新鲜的 3X 还原上样缓冲液。蛋白 A 琼脂糖珠：( #9863).10X 激酶缓冲液（用于激酶测定）：（#9802）要制备 1 ml 1X 激酶缓冲液，将 100 μl 10X 激酶缓冲液添加到 900 μl dH2O 中，混合 ATP (10 mM)（用于激酶测定）： (#9804) 要制备 0.5 ml ATP (200 µM)，请将 10 µl ATP (10 mM) 添加到 490 µl 1X 激酶缓冲液中。B。准备细胞裂解物吸出培养基。通过添加含有调节剂的新鲜培养基达到所需时间来处理细胞。要在非变性条件下收获细胞，去除培养基并用冰冷的 1X PBS 冲洗细胞一次。去除 PBS 并向每个板中添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液（10 cm) 并在冰上孵育 5 分钟。从板上刮下细胞并转移到微量离心管中。置于冰上。在冰上超声处理 3 次，每次 5 秒。4°C，14,000 x g 微量离心 10 分钟，并将上清液转移至新管。上清液是细胞裂解物。如有必要，可将裂解物储存在 -80°C.C 下。免疫沉淀细胞裂解物预清除（可选）涡旋混合珠子。将 10–30 µl 50% 蛋白 A 琼脂糖珠浆添加到 200 µl 细胞裂解物中，浓度为 1 mg/ml。在 4°C 下旋转孵育 30–60 分钟。 4°C 微量离心 10 分钟。将上清液转移到新试管中。继续进行下面的免疫沉淀。免疫沉淀

重要提示：强烈建议使用适当的同种型对照，以显示一抗免疫沉淀中的特异性结合。对兔多克隆一抗使用 Normal Rabbit IgG #2729，对兔单克隆一抗使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900，对小鼠单克隆 IgG1 一抗使用 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415，Mouse (E5Y6Q) ) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠单克隆 IgG2a 一抗，Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠单克隆 IgG2b primary 抗体和 Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠单克隆 IgG3 一抗。同种型对照应浓度匹配并与一抗样品一起运行。

将一抗（按照产品数据表中推荐的适当稀释度）以 1 mg/ml 的浓度添加到 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜。添加蛋白 A 琼脂糖（10–30 µl 50% 珠浆）。在 4°C 下旋转孵育 1-3 小时。在 4°C 下微量离心 30 秒。用 500 µl 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物五次。在两次清洗之间保持在冰上。通过蛋白质免疫印迹或激酶活性（D 部分）进行样品分析。样品分析

继续执行以下一组特定步骤。

通过蛋白质免疫印迹分析用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀。涡旋，然后以 14,000 x g 微量离心 30 秒。将样品加热至 95–100°C 2-5 分钟，然后以 14,000 x g 微量离心 1 分钟。上样（15–30 µl）在 4–20% 凝胶上用于 SDS-PAGE。通过蛋白质印迹分析样品（参见蛋白质免疫印迹实验方案）。

注意：当使用兔中产生的一抗检测分子量为在 50 kDa 的范围内，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262)​​ 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP 偶联物） #5127）作为二抗，以最大限度地减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量在 25 kDa 范围内的蛋白质，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127），以最大限度地减少变性小鼠轻链产生的干扰。

当使用小鼠产生的一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (# 58802) 作为二抗以最小化间质由变性小鼠重链产生的参考。

通过激酶分析进行分析用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。保持在冰上。将沉淀悬浮在 40 µl 1X 激酶缓冲液中，辅以 200 µM ATP 和适当的底物。在 30°C 下孵育 30 分钟。用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋，然后微量离心 30 秒。将含有磷酸化底物的上清液转移到另一个管中。将样品加热至 95-100°C 2-5 分钟，然后以 14,000 x g 微量离心 1 分钟。加载样品 (15-30 µl)在 SDS-PAGE 上 (4–20%)。

2008 年 12 月发布

2021 年 10 月修订

方案 ID：409

免疫组织化学（石蜡）A.溶液和试剂

注意：用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

二甲苯。乙醇，无水变性，组织学级（100% 和 95%）。去离子水 (dH2O)。苏木精（可选）。洗涤缓冲液：1X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：准备 1L 1XTBST 将 100 ml 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (#9997) 添加到 900 ml dH20 中，混合。SignalStain® 抗体稀释剂 (#8112)。1X 柠檬酸盐暴露溶液：要制备 250 mL 1X 柠檬酸盐暴露溶液，稀释 25 ml SignalStain ® 含 225 mL dH2O.3% 过氧化氢的 Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746)：要制备 100 ml，请将 10 ml 30% H2O2 添加到 90 mldH2O。封闭溶液：TBST/5% 正常山羊血清或 1X 动物-Free Blocking Solution.TBST/5% Normal Goat Serum：向 5 ml 1X TBST 添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。1X Animal-Free Blocking Solution：向 4 mL dH2O 添加 1 ml Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。检测系统：SignalStain® Boost IHC 检测试剂（HRP，兔 #8114）。底物：SignalStain® DAB 底物试剂盒 (#8059)。苏木精：苏木精 (#14166)。封固剂：SignalStain®安装介质 (#14177).B.脱石蜡/再水化

注意：在此过程中任何时候都不要让载玻片变干。

脱石蜡/水化切片：孵育切片在二甲苯中洗涤 3 次，每次 5 分钟。在 100% 乙醇的两次洗涤中孵育切片，每次 10 分钟。在两次 95% 乙醇的洗涤中孵育切片，每次 10 分钟。在 dH2O 中洗涤切片两次，每次 5 分钟。 C。抗原去掩蔽

对于柠檬酸盐：在微波中加热载玻片，浸没在 1X 柠檬酸盐去掩蔽溶液中，直到开始沸腾；随后在亚沸腾温度 (95°-98°C) 下 10 分钟。在工作台上冷却载玻片 30 分钟。

D.染色 在 dH2O 中洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。在 3% 过氧化氢中孵育切片 10 分钟。在 dH2O 中洗涤切片两次，每次 5 分钟。在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。用 100–400 µl 封闭每个切片1 小时的首​​选封闭溶液在室温下处理 1 小时。去除封闭溶液并向每个切片添加 100–400 µl 用 SignalStain® AntibodyDiluent (#8112) 稀释的一抗。在 4°C 下孵育过夜。将 SignalStain® Boost 检测试剂（HRP，兔 #8114）平衡至室温。取出一个抗体溶液并用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。根据需要用 1–3 滴 SignalStain® Boost 检测试剂（HRP，兔 #8114）覆盖切片。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。将 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB 显色剂浓缩液加入 1 ml SignalStain® DABDiluent 中，并在使用前充分混合。应用 100–将 400 µl SignalStain® DAB 加入每个切片并密切监测。 1–10 分钟通常可提供可接受的染色强度。将载玻片浸入 dH2O 中。如果需要，用苏木精 (#14166) 对切片进行复染。在 dH2O 中洗涤切片两次，每次 5 分钟。脱水切片：将切片在 95% 乙醇中孵育两次每次 10 秒。在 100% 乙醇中重复，将切片孵育两次，每次 10 秒。在二甲苯中重复孵育切片两次，每次 10 秒。用盖玻片和封固剂 (#14177) 封固切片。检测试剂/底物相容性推荐检测CTION REAGENTSSignalStain® Boost IHC 检测试剂（HRP，兔）#8114SignalStain® Boost IHC 检测试剂（AP，兔）#18653COMPATIBLE CHROMOGENSignalStain® DAB Substrate Kit #8059SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Sub策略套件 #96632SignalStain ® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit #12824SignalStain® Deep Black Peroxidase Substrate Kit #72986SignalStain® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit #69644

注意：使用本方案中指定以外的检测试剂可能需要进一步优化一抗以考虑用于检测试剂的不同灵敏度。

2010 年 2 月发布

2020 年 6 月修订

Protocol Id: 283

免疫荧光（免疫细胞化学）A.溶液和试剂

使用我们#12727 免疫荧光中高效且经济的预制试剂获得更高质量的免疫荧光图像应用解决方案套件

注意：使用反渗透去离子 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O，混合。将 pH 值调节至 8.0。甲醛：16%，不含甲醇，Polysciences, Inc.（目录号 18814），使用新鲜的并打开的小瓶在 4°C 避光条件下储存，在 1X PBS 中稀释以备使用。封闭缓冲液（1X PBS / 5 % 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 来自与二抗相同物种的正常血清（例如，Normal Goat Serum (#5425)）和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O，混合均匀。搅拌的同时，加入 30 µl Triton™ X-100。抗体稀释缓冲液（1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100）：要制备 10 ml，将 30 µl Triton™ X-100 添加到 10 ml 1X PBS 中。混合均匀，然后加入 0.1 g BSA (9998)，混合。

推荐的荧光染料偶联的抗兔二抗：

抗兔 IgG (H+L)，F(ab\')2 片段（Alexa Fluor ® 488 Conjugate) #4412Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 片段（Alexa Fluor® 555 偶联物）#4413Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F( ab\')2 片段（Alexa Fluor® 647 偶联物）#4414Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961).B.标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应直接在多孔板、腔室载玻片或盖玻片上生长、处理、固定和染色。

吸出液体，然后用在 1X PBS 中稀释的 4% 甲醛覆盖细胞至 2–3 mm 的深度。

注意：甲醛有毒，只能在通风橱中使用。

让细胞固定 15 分钟在室温下吸出固定剂，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。继续进行免疫染色（C 部分）。免疫染色

注意：除非另有说明，否则所有后续孵育均应在室温下进行，以防止干燥和荧光染料褪色。

Block specimen 在封闭缓冲液中 60 分钟。封闭时，按照产品网页上的说明在抗体稀释缓冲液中稀释以制备一抗。吸出封闭液，应用稀释的一抗。在 4°C 下孵育过夜。在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5每次 min。在抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中孵育样本 1-2 小时，室温避光。在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。盖玻片用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071 ) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961)。为获得最佳效果，请让封固剂在室温下过夜固化。对于长期储存，请将载玻片平放于 4°C 避光保存。

2006 年 11 月发布

2013 年 11 月修订

方案 ID： 24

流式细胞术，兔抗体 A 的甲醇透化协议。溶液和试剂

本协议所需的所有试剂都可以在我们的 In细胞流式细胞术试剂盒（甲醇）#13593，或单独使用下面列出的目录号。

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1X 磷酸盐缓冲盐水（PBS） )：要制备 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水混合物中。4% 甲醛，无甲醇 (#47746)100% 甲醇 (#13604)：使用前冷藏抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或通过将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 溶解在 100 ml 1X PBS 中来制备 0.5% BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。推荐的抗兔二抗::抗兔 IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412Anti-Rabbit IgG (H+L), F (ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab\')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414Anti-Rabbit IgG (H+L), F (ab\')2 Fragment (PE Con​​jugate) #79408

注意：当包含荧光细胞染料时，我在您的实验中（包括活性染料、DNA 染料等），请参阅染料产品页面以了解推荐的方案。请访问 www.cellsignal.com 以获取经过验证可用于流式细胞术的细胞染料的完整列表。

B.固定

注意：贴壁细胞或组织应在固定前解离并置于单细胞悬液中。

注意：最佳离心条件将因细胞类型和试剂体积而异。通常，150-300g 1-5 分钟就足以沉淀细胞。

注意：如果使用全血，裂解红细胞并在固定前离心洗涤。

注意：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，则可以在固定前添加靶向 CD 标记或其他细胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中，抗体将保持与目标靶标的结合。但是，请注意一些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此应该透化前不添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

离心沉淀细胞并去除上清液。每 100 万个细胞用大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。充分混合以分离沉淀并防止单个细胞交联。在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。用过量的 1X PBS 离心洗涤。在适当的废物容器中丢弃上清液。在 0.5-1 ml 1X PBS 中重悬细胞。继续进行透化步骤。或者，细胞可以在 4°C 的 1X PBS.C 中储存过夜。通透化通过将冰冷的 100% 甲醇缓慢加入预冷的细胞中来通透细胞，同时轻轻涡旋，使甲醇的最终浓度达到 90%。在冰上通透化至少 10 分钟。继续进行免疫染色（D 部分）或储存细胞在 -20°C 的 90% 甲醇中。免疫染色

注意：使用血细胞计数器或替代方法对细胞进行计数。

等分所需的细胞数量 i进入试管或孔中。 （通常，每次测定 5x105 至 1x106 个细胞。）通过在过量的 1X PBS 中离心来洗涤细胞以去除甲醇。将上清液丢弃在适当的废液容器中。必要时重复。在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，该抗体在抗体稀释缓冲液中按推荐稀释度制备或通过滴定确定。在室温下孵育 1 小时。在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心洗涤。丢弃上清液。重复。在 100 µl 稀释的荧光染料偶联二抗中重悬细胞（按推荐稀释度在抗体稀释缓冲液中制备）。在室温下孵育 30 分钟。避光。在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中离心洗涤。丢弃上清液。重复。在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞并在流式细胞仪上进行分析。

2009 年 7 月发布

2020 年 6 月修订

Protocol Id : 404

特异性/灵敏度磷酸化 Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb 仅在 Ser473 磷酸化时检测内源水平的 Akt1。当相应残基磷酸化时，该抗体也可识别 Akt2 和 Akt3。物种反应性：

人类、小鼠、大鼠、仓鼠、猴子、黑腹果蝇、斑马鱼、牛

物种预测根据 100% 序列同源性进行反应：用于生产该抗体的抗原序列与此处列出的物种具有 100% 序列同源性，但反应性尚未经过 CST 测试或证实有效。我们的抗体不涵盖将本产品用于这些物种性能保证.

Chicken, Xenopus, Dog, Pig

来源/纯化

单克隆抗体是用相应的合成磷酸肽免疫动物产生的

背景

Akt，也称为 PKB 或 Rac，在控制存活和细胞凋亡中起关键作用 (1-3)。这种蛋白激酶e 被胰岛素和各种生长和存活因子激活，在涉及 PI3 激酶的渥曼青霉素敏感通路中发挥作用 (2,3)。 Akt 通过磷脂结合和 PDK1 (4) 在 Thr308 处的激活环磷酸化以及通过在羧基末端在 Ser473 处的磷酸化来激活。之前难以捉摸的负责 Akt 在 Ser473 位点磷酸化的 PDK2 已被鉴定为雷帕霉素 (mTOR) 的哺乳动物靶标，与 rictor 和 Sin1 形成雷帕霉素不敏感复合物 (5,6)。 Akt 通过磷酸化和失活多个靶标来抑制细胞凋亡，从而促进细胞存活，这些靶标包括 Bad (7)、叉头转录因子 (8)、c-Raf (9) 和 caspase-9。 PTEN 磷酸酶是 PI3K/Akt 信号通路的主要负调节因子 (10)。 LY294002 是一种特异性 PI3 激酶抑制剂 (11)。 Akt 的另一个重要功能是通过 GSK-3α 和 β 的磷酸化和失活来调节糖原合成 (12,13)​​。 Akt 也可能在胰岛素中发挥作用lin 刺激葡萄糖转运 (12)。除了在存活和糖原合成中的作用外，Akt 还通过阻止 GSK-3β 介导的细胞周期蛋白 D1 (14) 磷酸化和降解以及通过负向调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p27 Kip1 (15) 和p21 Waf1/Cip1 (16)。 Akt 还通过直接磷酸化含有 raptor 的雷帕霉素敏感复合物中的 mTOR，在细胞生长中发挥关键作用 (17)。更重要的是，Akt 磷酸化和失活块蛋白 (TSC2)，一种 mTOR-raptor 复合体中的 mTOR 抑制剂 (18,19)。

Franke, T.F.等。 (1997) Cell 88, 435-7.Burgering, B.M.和 Coffer, P.J. (1995) Nature 376, 599-602.Franke, T.F.等。 (1995) Cell 81, 727-36.Alessi, D.R.等。 (1996) EMBO J 15, 6541-51.Sarbassov, D.D.等。 (2005) Science 307, 1098-101.Jacinto, E. 等人。 (2006) Cell 127, 125-37.Cardone, M.H.等。 (1998) Science 282, 1318-21.Brunet, A. 等人。 (1999) Cell 96, 857-68.Zimmermann, S. 和 Moelling, K. (1999) Science 286, 1741-4.Cantley, L.C.和尼尔，B.G. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96, 4240-5.Vlahos, C.J. 等。 (1994) J Biol Chem 269, 5241-8.Hajduch, E. 等。 (2001) FEBS Lett 492, 199-203.Cross, D.A.等。 (1995) Nature 378, 785-9.Diehl, J.A.等。 (1998) Genes Dev 12, 3499-511.Gesbert, F. 等。 (2000) J Biol Chem 275, 39223-30.Zhou, B.P.等。 (2001) Nat Cell Biol 3, 245-52.Navé, B.T.等。 (1999) Biochem J 344 Pt 2, 427-31.Inoki, K. 等人。 (2002) Nat Cell Biol 4, 648-57.Manning, B.D.等。 (2002) Mol Cell 10, 151-62.Pathways

探索与该产品相关的通路。

选择您的通路AMPK 信号转导粘附连接动力学阿尔茨海默病血管生成细胞凋亡调节B 细胞受体信号转导ESC 多能性和分化ErbB/HER 信号转导G1/S 信号转导抑制细胞凋亡胰岛素受体信号转导微管动力学细胞凋亡的线粒体控制NF-kB 信号转导PI3K/Akt 信号转导蛋白激酶C 信号转导T 细胞受体信号nalingTGF-ß SignalingTranslation: eIF4E and p70S6KWarburg EffectmTOR Signaling×上游/下游蛋白质

STRING - 已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用。

关闭数据库链接

UniProt ID：P31751、Q9Y243、P31749

Entrez-Gene Id:208, 10000, 207

®\">在 PhosphoSitePlus®

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